難純化ウイルスに対する複製型二本鎖RNAからの遺伝子のクローニングと抗血清の作製

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04660042
• Research Institution: Utsunomiya University
• Principal Investigator: 夏秋 知英 宇都宮大学, 農学部, 助教授 (10134264)
• Keywords: 植物ウイルス / 二本鎖RNA / 遺伝子 / クローニング / 融合タンパク質 / 血清反応

Research Abstract

本研究では、病原ウイルスの純化が因難なために現在まで抗血清が作製されていない難純化ウイルスを対象として、まずウイルスゲノムに対応した複製型二本鎖RNAをウイルス感染植物から抽出し、これを用いて病原ウイルスの遺伝子に対応したcDNAのクローニングを行うことを第一の目標としている。さらに、ウイルス遺伝子のコードするタンパク質に対応した塩基配列を決定し、大腸菌に融合タンパク質としてウイルスのタンパク質を産生させ、抗血清を作製することを最終目的としている。平成5年度では、果樹ではカンキツトリステザウイルス(CTV)、イチゴではイチゴマイルドイエローエッジウイルス(SMYEV)を取り上げて実験を行い、以下のような知見が得られた。
1.CTVでは複製型二本鎖RNAからCTV-RNAのクローニングに成功した。得られたcDNAクローンのひとつは外被タンパク質を産生する能力をもっていた。その塩基配列を決定し、日本産CTVの外被タンパク質遺伝子と米国産のものが比較できた。以上の点から、複製型二本鎖RNAを用いた植物ウイルス遺伝子のクローニングが実用的技法であることが証明された。
2.さらに外被タンパク質遺伝子近傍のCTV-RNAの塩基配列を調べたところ、日本には未発生のbeet yellows closterovirusとCTVが近縁であることが明らかとなった。またCTVの外被タンパク質遺伝子が重複したと考えられる外被タンパク質類似タンパク質に対する抗血清を作製した。
3.SMYEVは、いまだにウイルス粒子の形態すら未確認であるため、接木試験で発病した多数のイチゴから複製型二本鎖RNAを抽出し、cDNAのクローニングに成功した。このcDNAの塩基配列を決定したところ、報告のある植物ウイルスの塩基配列とは一致しなかった。

Research Products

• [Publications] 夏秋 知英: "最近の遺伝子診断法の開発状況とカンキツウイルスへの利用について" 平成4年度果樹課題別研究会資料. 32-37 (1993)
• [Publications] 夏秋 知英: "Cryptovirusの遺伝子解析" 植物ウイルス病研究会レポート. 2. 52-59 (1993)
• [Publications] 岩花 典子・夏秋 知英・加納 健・奥田 誠一: "カンキツトリステザウイルス数種分離株からの外被タンパク質類似25.7Kタンパク質遺伝子の検出" 日本植物病理学会報. 59. 727 (1993)
• [Publications] 加納 健・夏秋 知英・岩花 典子・奥田 誠一: "カンキツトリステザウイルス数種分離株からの外被タンパク質遺伝子のPCRによる検出" 日本植物病理学会報. 60. (1994)