プルラナーゼの活性部位構造と基質特異性に関する分光学的・速度論的研究

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04660097
• Research Institution: Fukuyama University
• Principal Investigator: 廣海 啓太郎 福山大学, 工学部, 教授 (50025425)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 室岡 義勝 広島大学, 工学部, 教授 (60029882) ; 岩本 博行 福山大学, 工学部, 助手 (90213321) ; 廣瀬 順造 福山大学, 工学部, 助教授 (70080215)
• Keywords: プルラナーゼ / シクロデキストリン / 活性部位構造 / マルトオリゴ糖 / オリゴ糖アリコール / 酵素反応速度論 / 変異酵素

Research Abstract

1) Klebsiella pneumoniae由来のプルラナーゼの結晶標品につき、α-、β-、γ-シクロデキストリンとの相互作用を、プルランを基質とする酵素反応の阻害、ならびに紫外部吸収差スペクトル、蛍光スペクトルの変化を指標として詳細に研究した。3種のシクロデキストリン(CDと略す)はいずれも拮抗型の阻害を示し、その阻害物質定数Kiは蛍光滴定から求められた酵素-シクロデキストリン複合体の解離定数Kdと一致した。中でもβ-CDは最も結合が強く、α-、γ-CDに比べて親和力が約2.5kcal/molも大きい。また紫外部の吸収差スペクトルもβ-CDだけが微妙に異っており、カロリメトリーから得られた結合の標準エントロピー変化DS°もβ-CDのみが正の値を示すなど、β-CDは酵素に対して特徴的な結合様式をとることが知られた。
2) 同酵素と重合度を異にするマルトオリゴ糖及び対応する糖アルコール類との相互作用を、同様に阻害及び蛍光スペクトル変化について調べた。上記のCDの場合と異なり、KiとKdは一致せず、基質の結合を妨げる部位と、トリプトファン残基の微環境変化による蛍光変化を生じる部位の2種類があることが示唆された。
3) β-CDにトシル基、ダンシル基を導入した誘導体につき、阻害物質定数を検討した結果、酵素の活性部位に存在する疎水性側鎖がβ-CDの環内に貫入することにより、酵素との結合を強めている可能性を示唆する実験結果が得られた。
4) Klebsiella aerogenesのプルラナーゼにつき、数種の変異酵素を作成した。その中のあるものは、野性型酵素よりも高温で活性を保持していた。また部位特異的変異により、全く活性を失った変異酵素も得られた。

Research Products

• [Publications] H.Iwamoto et al.: "Interaction between Pullulanase from Klebsiella pneumoniae and Cydodextrins" J.Biochemistry. 113. 93-96 (1993)
• [Publications] 岩本 博行 ら: "Klebsiella pneumoniae 由来のプルラナーゼとオリゴ糖との相互作用"
• [Publications] 山下 光雄 ら: "プルラナーゼの耐熱化酵素への改変"
• [Publications] 松本 大 ら: "プルラナーゼの基質結合部位の同定"