T-タイプカルシウム・チャンネル遺伝子のクローニング

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04670108
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 五ノ井 透 千葉大学, 真核微生物研究センター, 助手 (30134365)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清野 進 千葉大学, 医学部, 教授 (80236067)
• Keywords: Caチャンネル / 遺伝子クローニング / ミエローマ細胞 / Oocyte / PCR法

Research Abstract

TータイプのCa^<2+>チャンネルを発現するmyeloma細胞よりRNAを取り、ランダム プライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて、cDNAを作製した。すでに報告されているLータイプのCa^<2+>チャンネルのアミノ酸配列をもとに、チャンネルの機能に一般的に重要で、チャンネルのタイプを越えて保存されていると思われる配列(IVS3ーIVS4附近)について、縮退したオリゴDNAプライマーを化学合成し、PCR法により上記cDNAからチャンネルのものと思われる遺伝子を増幅し、配列を決定した。新たに得られた配列をもとに、同様のPCR法によりこれまでに報告はされていないが、チャンネルの配列にホモロジーが高い新しい配列を見つけ、2Kベースに渡り、配列を決定した。
得られた配列のなかで、特にユニークで他のチャンネルに見られない配列について 40ベースのアンチセンス オリゴDNAを化学合成した。このオリゴDNAをプローブとし、もとのmyeloma細胞および 対照の細胞のRNAについて、ノーザンブロット ハイブリダイゼーションを行ったところ、プローブは、myeloma細胞の8Kベース附近のRNAには結合するが、TータイプのCa^<2+>チャンネルをほとんど発現しない対照のマウス骨格筋由来のC_2C_<12>細胞、マウスmyeloma細胞MPC11細胞のRNAにほとんど結合しないことが分かった。すなわちこの遺伝子は、目的のTータイプCa^<2+>チャンネル遺伝子である可能性が高い。
さらに、カエルのOocyteにこの遺伝子を発現させるために、また上記(研究計画・方法、変更点の項参照)の様にアンチセンス オリゴによる発現の阻害実験を行うための実験系が必要であり、Oocyteから電流記録を行うための、コンピューター制御の膜電位固定用、刺激および記録装置を作製、準備した。

Research Products

• [Publications] Akao.M 他3名: "Isolation of a metastasizing cancer cell line from an aflatoxinB_1ーinduced rat liver tumor" Chem.Pharm.Bull. 40. 1299-1302 (1992)
• [Publications] Nagai,N 他4名: "Biological activities of novel polyether antifungals,gambieric A and B from a marine dinoflagellate Gambierdiscus Toxicus" Journal of Antibiotics.
• [Publications] Tohru Gonoi: "Patch-clamp study of developmental changes in voltage dependent ion channels of mouse skeletal muscle fibres" Annals of the New York Academy of Sciences.