自己抗体が認識するDNA末端結合蛋白の生理活性と膠原病における病因的意義

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04670395
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 三森 経世 慶應義塾大学, 医学部・内科, 助手 (10157589)
• Keywords: 自己抗体 / Ku抗原 / DNA末端結合蛋白 / オクタマー配列 / DNA依存性蛋白キナーゼ / 膠原病

Research Abstract

強皮症-多発性筋炎重複症候群患者に見いだされる抗Ku抗体の対応抗原(Ku抗原)は70kD/80kDのヘテロ蛋白二量体から構成される二重鎖DNA末端結合蛋白であるが,これまでその生物学的機能は不明であった。本年度は,Ku抗原の生物活性を追求した。
1)Ku蛋白結合DNAの分析:プロテインAセファロース粒子上に抗Ku抗体とHeLa細胞抽出物が反応して形成された免疫複合体中のDNAをフェノール抽出し、M13ベクターにサブクローニングして,その塩基配列を決定した。30個のクローン(平均鎖長200bp)を同定したところ,遺伝子データバンクに登録されたDNAとの相同性は認められなかった。しかし,これらのDNAにはオクタマー配列類似の配列(ATTTG/T C/T A/T T)が延べ25回,トランスフェリン受容体プロモーターなどに見られる塩基配列(G/A GAAGTNA C/G)が延べ10回認められた。このことは,Ku抗原がDNA末端のみならず,特定の塩基配列を認識してDNAに結合する可能性が示唆された。
2)DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA‐PK)とKu抗原の関連:35〓Sメチオニン標識HeLa細胞を、生理的塩濃度(0.15M NaCl)で免疫沈降すると,Ku蛋白のみならず,350kDの大分子量蛋白を同時に沈降した。この蛋白はDNA‐PK(p350)に対する家兎免疫血清で認識されることから,DNA‐PKの触媒サブユニットp350自身であることが確認された。このKu蛋白とp350の結合にはDNAが必要で,0.5M NaClでは可逆的に解離した。DNA‐PK基質であるGAL4‐CTD融合蛋白のin vitroリン酸化反応は抗Ku抗体の存在によって特異的に阻害された。以上の結果は,Ku抗原がp350とともにDNA‐PKホロ酵素を形成し,Ku抗原はDNA‐PKの活性化サブユニットとして働く可能性を示唆した。

Research Products

• [Publications] Kuwana M,Mimori T et al: "Autoantibody reactive with three classes of RNA polymerases in sera from patients with systemic sclerosis." J.Clin.Invest.91. 139-1404 (1993)
• [Publications] Tsuzaka K,Mimori T et al: "Nonprecipitating IgG or IgM anti‐Sm antibody:Clinical significance and changes in immunoglobulin class." J.Rheumatol.20. 822-830 (1993)
• [Publications] Kuwana M,Mimori T et al: "Autoantigenic epitopes on DNA topoisomerase I:Clinical and immunogenetic associations in systemic sclerosis." Arthritis Rheum.36. 1406-1413 (1993)
• [Publications] Tsuzaka K,Mimori T et al: "Clinical significance of antibodies to native or denatured 60‐kd or 52‐kd Ro/SS‐A proteins in Sjogren〓s syndrome." Arthritis Rheum.37. 88-92 (1994)
• [Publications] Satoh M,Mimori T et al: "Genetic and immunological differences between Japanese patienta with diffuse scleroderma and limitted scleroderma." J.Rheumatol.21. 111-114 (1994)
• [Publications] 三森経世: "膠原病診断法と活動性の評価-全身性エリテマトーデス" Medicina. 30. 1864-1866 (1993)
• [Publications] 三森経世ほか: "自己抗原遺伝子の研究-Ku抗原.「自己免疫とトレランス」pp140-148" 中外医学社(編集:山本一彦), 249 (1993)
• [Publications] 三森経世ほか: "膠原病.「臨床遺伝医学(III)-分子病」pp542-548" 診断と治療社(編集:清水信義), 643 (1993)