C型肝炎ウイルス関連蛋白および遺伝子の肝細胞内における検出に関する研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04670419
• Research Institution: NIIGATA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 上村 朝輝 新潟大学, 医学部, 助教授 (70018894)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大越 章吾 新潟大学, 医学部・附属病院, 助手 (70231199)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / HCV-RNA / HCVコア蛋白 / In situ hybridization

Research Abstract

1.方法
C型慢性肝炎の肝組織中におけるHCV RNAの動態ならびに局在を明らかにするため、digoxigenin標識cDNAプローブを用いたin situ hybridization法を施行した。C型慢性肝炎患者血清より総RNAを抽出し、cDNAプールを作成した。このcDNAプールをテンプレートとしてHCVコア領域の部分配列cDNAを得た。このcDNAクローンを用いてPCRを行なう際に、digoxigenin-11-dUTPを一定の割合でdNTP mix中に加えることにより、digoxigenin標識cDNAを得る。C型慢性肝炎患者の肝生検組織標本を急速凍結しクリオスタットで10μ切片作成後、固定し洗滌、脱水後3ng/μlのcDNA濃度で42℃、14〜16時間ハイブリダイゼーションを行なった。洗滌後ブロックを施し、抗digoxigenin抗体で反応させ、NBTとBCIPにて発色反応を行なった。なお内因性のアルカリフォスファターゼはレバミゾールで阻止した。B型慢性肝炎例を対照として検討した。
2.成績
c型慢性肝炎例ではアルカリフォスファターゼ染色の反応産物が肝小葉内に散在性に、あるいはクラスターをなして観察された。高倍率で観察すると、これらの反応産物は肝細胞の主として細胞質内に局在していた。肝細胞以外の細胞内にはかかる反応産物は認められなかった。cDNAプローブと反応させなかった組織切片上にはこれらの反応産物は認めなかった。またB型慢性肝炎例の肝組織にもこれらの反応産物は見られなかった。肝組織をあらかじめ20μg/mlのRNase Hで処理しておくと陽性の反応産物がみられなくなった。

Research Products

• [Publications] Kobayashi T: "Titer of antibodies associated with hepatitis C virus during and after interferon therapy:Evaluation of anti-C100 and anti-core antibodies" Acta Medica et Biologica. 40. 56-67 (1992)
• [Publications] 大越章吾,上村朝輝: "C型慢性肝疾患とその他の慢性肝疾患の鑑別" 治療. 74. 2035-2040 (1992)
• [Publications] Ohkoshi S,Kamimura T et al.: "Clinical evaluation of the antibody against core protein of hepatitis C virus" Gastroenterologia Japonica. 20. 80-83 (1993)
• [Publications] Watanabe M,Kamimura T et al.: "Hepatitis C viral markers in patients who received blood that was positive for hepatitis C virus core antibody,with genetic evidence of hepatitis C virus transmission" Transfusion. 34. 125-129 (1994)