白血病治療における微少残存白血病の評価に関する研究

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04670610
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 松山 秀介 横浜市立大学, 医学部, 教授 (20045983)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 甲斐 純夫 横浜市立大学, 医学部, 助手 (10233644) ; 生田 孝一郎 横浜市立大学, 医学部, 講師 (80159590) ; 佐々木 秀樹 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (50106316)
• Keywords: Bリンパ系白血病 / 微少残存白血病細胞 / PCR法

Research Abstract

1.免疫グロブリン重鎖遺伝子超可変領域(DH)の患者白血病細胞特異的塩基配列の決定
当初の計画のとおり、Bリンパ系の白血病患者の初発時骨髄細胞よりDNAを抽出し、このうちの10例についてPCR(Polymerase Chain Reaction)法を用いてDH領域のDNAを増幅した。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、10例中8例では単一のバンドが認められ、単クローン性のDNA増幅が確認された。しかし残る2例ではDNAが増幅されず、原因としてDH領域の再構成が起こっていないためと考えられた。次に、DNA増幅の得られたDNAのうち5例について、Dideoxy法を用いて患者白血病細胞特異的な塩基配列を決定した。このうちの4例について詳細な解析を行い、最も特異性の高い部分の塩基配列をもとに、サザンブロットハイブリダイゼーション用のプローブをデザインし、これを作成した。
2.完全寛解中の骨髄における微小残存白血病細胞の同定
プローブを作成した4例の患者について、寛解期骨髄よりDNAを抽出し、同様にPCRを行い、DH領域を増幅した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動し、ナイロンフィルターに移した後、先の作成したプローブを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーションを行い、その結果を解析した。完全寛解以降、強化療法を継続するに従ってバンドは薄くなり、最終的に消失すると予想されたが、臨床経過や形態学的所見とは無関係に非特異的バンドが出現してしまった。原因として、(1)PCRの設定条件による非特異的塩基配列の出現、(2)ハイブリダイゼーションの温度設定等による非特異的バンドの出現、(3)特異的プローブのデザイン不良による特異性の低下、等が考えられ、現在、これらの条件について再度検討中である。