脳に特異的に存在する14kDa(PNP14)タンパク質の生理機能の解明

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04671370
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 中条 茂男 昭和大学, 薬学部, 助教授 (50119236)
• Keywords: 神経特異的タンパク質 / チロシンリン酸化 / in situハイブリダイゼーション / PNP14

Research Abstract

(1)ラット脳におけるPNP 14 mRNAの検出をin situハイブリダイゼーション法を用いて行った。Biotin-21-dUTPを用いるcDNA標識法では十分なシグナルが得られなかったので,〔^<35>S〕dCTP/ランダムブライマー法に変更して行った。その結果,大脳においてPNP 14 mRNAの発現は梨状皮質,海馬(CA1〜4,歯状回)で高かった。これらの部位はPNP 14タンパク質の存在部位と一致していた。一方,小脳では顆粒層のみにmRNAの発現が認められ,分子層,プルキンエ層,髄質では検出されなかった。タンパク質は分子層に最も多量に,次いで顆粒層にみられることから,PNP 14の合成場所は顆粒層で,その後分子層へと運ばれるものと推定された。
(2)ELISAに関しては,抗PNP 14血清からIgGを精製し,ペプシン消化,還元後にFab'を得た。これにマレイミド基を導入したペルオキシダーゼ(HRP)を作用させ,Fab'ヒンジ部の-SH基を介して結合させることによりHRP標識Fab'を調製した。調製した酸素標識抗体をサンドイッチ法ELISAに適用した。最高検出感度は0.5ng/wellで,分子量,および脳に多量に存在するという点で類似するカルモデュリン,S-100とは全く交差反応を示さず本法は満足すべきものであった。現在,本法によりPNP 14タンパク質の組織内含量について詳細に検討中である。
(3)EGF受容体を用いてPNP 14をリン酸化後,そのチロシンリン酸化部位を同定した。チロシンを含む部分配列に相当するペプチドをFast Fmocケミストリーに従って化学合成した。それぞれのペプチドを基質に用い,in vitroキナーゼ反応を行って解析した結果,Tyr39がEGF受容体のリン酸化部位であることを明らかにした。