1992 Fiscal Year Annual Research Report
カルシウムによる遺伝子転写調節因子のクローニングー細胞内導入及び発現に向けて
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04671463
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岡崎 具樹 東京大学, 保健センター, 講師 (60203973)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
五十嵐 徹也 東京大学, 医学部分院, 助教授 (00134601)
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| Keywords | カルシウム / 転写因子 |
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| Research Abstract |
細胞外液カルシウム(Ca)による遺伝子発現抑制機構にかかわる核内転写因子(nCaREB)の構造解明を目的に、まず、SDSポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)と標識オリゴヌクレオチド(nCaRE)を用いて、培養細胞核蛋白のサウスウェスタン解析を行なった。その結果、高濃度のジスレイオトール(DTT)存在下で、塩基配列特異的にnCaREと結合する約35キロダルトン(KDa)の蛋白を見いだした。この蛋白のDNA結合活性は、細胞外液Ca濃度の上昇に伴い増強した。次に、nCaREBをクローニングする目的で同様のサウスウェスタン法を用いてHeLa細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした。その結果得られた3種のクローンのうちの一つ、分子量37KDaの蛋白refl(redox factorl)についての解析を進め、以下の知見を得た。1)大腸菌で大量発現させたreflのSDS-PAGEを行い、サウスウェスタン法により、このreflがやはりnCaREと特異的に結合することをゲル上で確かめた。2)ほ乳類培養細胞にトランスフェクションしたreflは、ゲルシフトアッセイにおいてnCaREB活性を明らかに増強した。3)in vitro translationによって発現させたreflにはDNA結合活性は殆ど見られなかった。このことは、細菌や培養細胞において保存されているなんらかの蛋白修飾機構(酸化還元反応など)が、reflのDNA結合に必要であることを示す。4)培養細胞にreflを導入した系において、nCaREを含むレポーター遺伝子を同時導入し、細胞外液Ca濃度の変化が、レポーター活性に与える効果を調べた。その結果、reflなしで認められた、細胞外液Ca濃度依存的なnCaREを介するレポーター活性の低下がrefl存在下では消失し、高い外液Ca濃度の場合ばかりでなく、低い外液Ca濃度においてもレポーター活性は低下したままであった。このことは外液Caによる情報がreflに伝わる機構は未だ不明であるものの、reflがnCaREBそのものか、または、少なくともnCaREBの活性を増強する核蛋白であることを強く示唆する。
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[Publications] Okazaki,T.: "Negative regulatory elements in the human parathy roid hormone gene." J.Biol.Chem.262. 21903-21910 (1991)
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[Publications] Okazaki,T.: "Conserved mechanism of negative gene regulation by extracellular calcium-parathyroid hormone gene versus atrial natriuretic polypeptide gene." J.Clin.Invest.89. 1268-1273 (1992)
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[Publications] Okazaki,T.: "Transcnptional control of the PTH gene:negative calcium responseve element" Progress in Endocrinology.
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[Publications] 岡崎 具樹: "カルシウムによる遺伝子発現調節機構" 内分泌学の進歩. 10. 102-115 (1993)
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[Publications] Igarashi,T.: "A New Mode for Ca^<2+> Requlation K.Kohama ed." Japan Scientific Society Press/CRC Press, 205(129-143) (1992)
