線維芽細胞由来プロスタサイクリン産生刺激因子の分離,精製

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04671487
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 梅田 文夫 九州大学, 医学部, 助教授 (80150431)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 迫 康博 九州大学, 医学部, 助手 (90187104)
• Keywords: 線維芽細胞 / 血管内皮細胞 / プロスタサイクリン産生因子 / 精製 / クローニング

Research Abstract

我々は培養ウシ血管内皮細胞を用い、培養液中に産生されたプロスタサイクリン(PGI_2)の安定代謝産物6-keto-PGF_1alphaをRIAにて測定することにより、PGI_2産生刺激活性の生物学的測定系を確立している。この測定系を利用して、ヒト線維芽細胞由来プロスタサイクリン産生刺激因子(PSF)の分離、精製を行なった。線維芽細胞培養上清(CM)試料を用いてHPLCにより精製した。DEAE-5PW陰イオン交換カラム、HEPARIN-5PW、PROTEIN-PAK300ゲル濾過カラム、IGF-アフィニティカラム、C_4-逆相カラムを順次用いることにより、SDS-PAGE上分子量約30KDaの単一蛋白因子として精製した。そこで、精製試料のアミノ酸シークエンスを決定し、線維芽細胞のcDNAライブラリーより遺伝子クローニングを行い、PSFのcDNAの塩基配列及び一次構造を決定した。現在、COS細胞を用いて、レコンビナントPSFの発現実験を鋭意に実行中である。さらに、cDNAプローブを用いて、ラットの各臓器におけるPSFの発現をノザンブロッティング法にて検討したところ、肺、腎に強い発現を認めた。また、肝、心、骨格筋、脂肪にも発現が認められた。興味ある所見として、血管壁細胞、特に血管平滑筋細胞(SMC)、血管内皮細胞(EC)にも強い発現を認めた。一方、抗PSFポリクローナル抗体を作成し、ヒトの各臓器の免疫組織染色を行なったところ、小血管壁のSMC、ECに特異的な染色性を認めた。また、この抗PSF抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法にても検討したところ、EC及びSMCの培養上清中にもPSFの存在を確認した。また、ヒト血清及び血漿をヘパリンカラムで精製後、ウェスタンブロッティング法で検討すると、ヒト血清中にもPSFが存在することが判明した。そこで、血中のPSF濃度をELISA法にて測定したが感度以下であり、将来臨床で応用出来るように、現在高感度測定系を改良中である。

Research Products

• [Publications] 梅田 文夫: "糖尿病性血管障害とプロスタグランジン代謝異常" 糖尿病と脂質代謝. 9. 87-97 (1993)
• [Publications] Yamauchi T.,Umeda F.,Masakado M.,Ono Y.,Nawata H.: "Serum free conditioned medium of human diploid fibroblast cells contains an activity that stimulates prostacyclin production by cultured bovine aortic endothelial cells" Biochemistry and Molecular Biology International. 31. 65-71 (1993)