インスリン受容体遺伝子特異的転写調節因子の精製とcDNAクローニング

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04671492
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 岸川 秀樹 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (30161441)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 榊田 典治 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (50170577) ; 七里 元亮 熊本大学, 医学部, 教授 (00028515)
• Keywords: インスリン受容体 / 核蛋白 / HepG2細胞

Research Abstract

核蛋白であるSp1蛋白が、インスリン受容体遺伝子プロモーター領域に結合し、転写活性を高めることを認め、さらに、インスリン受容体遺伝子プロモーター領域に結合し、転写活性を高めるHepG2細胞特異的転写因子が存在することを認めた。HepG2細胞特異的なインスリン受容体転写調節因子の結合部位はSp1蛋白が結合するGCボックスの近傍にあることを明らかにし、その核蛋白結合部位を決定した。粗抽出核蛋白を用いたゲルシフト分析でも、標識オリゴヌクレオチド(-639/-629)をプローブとして用いると、CHO細胞、COS細胞では電気泳動上、移動を認めなかったが、HepG2細胞から抽出した粗抽出核蛋白では移動を認めた。さらに、精製Sp1蛋白を添加しても、バンドの移動を認めなかったので、Sp1j異なる遺伝子転写活性を制御する核蛋白と考えられた。この結果、ヒトインスリン遺伝子5'上流約600bpにあるGCボックスのさらに上流の約11bpの範囲に結合する蛋白がHepG2細胞に存在することが確認された。
また、HePG2細胞を大量に培養し、その核蛋白を抽出した。インスリン受容体プロモーター領域の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド(-639/-629)との結合能をゲルシフトアッセイ及びDNAaseI foot print法により確認しつつ、抽出を繰り返し、精製率を高めている。今後、精製した蛋白の一部アミノ酸の配列を決定し、これをもとに合成オリゴヌクレオチドをプローブを作成する。このプローブを用い、HepG2のDNAライブラリーをスクリーニングし、その塩基配列を決定する。