Na^+/I^-symporterのクローニングと発現

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04671493
• Research Institution: 宮崎医科大学
• Principal Investigator: 小谷 富男 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10161936)
• Keywords: ヨードポンプ / CDNAクローニング

Research Abstract

Na^+/I^-‐symporterのexpression cloningを目的に、FRTL‐5から抽出したmRNAを用いてcDNAを作製し、これを発現vector pCDM8に捜入。500〜2,000コロニーからなるプールからplasmidを抽出しCos7に transfection、Cos7の^<125>Iの取り込みを見た。一次スクリーニングにおいて有意にアイソトープ活性の強かった5プールそれぞれにつき、1/5のコロニー数からなる約30プールを作製し、一次スクリーニングと同様のスクリーニングを行った。プラスミッドを含む大腸菌のコロニー数を1/5にすることにより、目的とするsymporterのcDNAを含むプールでは一定量のプラスミッドをCos7にtransfectionする関係上、アイソトープの取り込みが増加し活性もより強くなると考えた。しかし、予想に反して一次スクリーニングの結果より強いアイソトープ活性を示すプールはなかった。原時点において、プラスミッドをtransfectionしたCos7に^<125>Iを取り込ませるというスクリーニングシステムそのものに問題があると考えている。 今後、スクリーニングのシステムを変更することにより、sympoterのcDNAクローニングは可能と考えている。即ち、Vilijinらが行ったXenopus oocyteにmRNAを注入し^<125>Iを取り込ませる方法である。大腸菌コロニーのプールからプラスミッドを抽出したのち、in vitroでmRNAを合成し、このmRNAをoocyteに注入したい。pCDM8にはT_7プロモータが組み込まれているので、これを利用してin vitroでmRNAを合成し得る。