ラットウイルス(RV)感染の遺伝子診断に関する研究

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04680041
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 八神 健一 筑波大学, 基礎医学系, 助教授 (40166476)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉山 文博 筑波大学, 基礎医学系, 助手 (90226481) ; 杉山 芳宏 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (10187685)
• Keywords: ラットウイルス / パルボウイルス / 遺伝子診断 / PCR

Research Abstract

平成5年度は以下のことを実施した。
1.遺伝子増幅用Primerの作成:RVのみならず近縁のげっ歯類由来Parvovirus(H-1,MVM)のDNAも同時に検出できること、各ウイルスの型別も可能なこと、をPrimerの条件とした。前者の目的のために保存性の高い非構造タンパク(NS-1)をコードする領域中の(370bp)を増幅するよう21merおよび22merのPrimer Aを作成した。また、後者の目的のためVP-1領域の(262bp)を増幅するよう19merおよび21merのPrimer Bを作成した。
2.PCR反応条件の検討:反応条件を検討した結果、1.5mM MgCl2存在下で、94C,1分;60C,2分;72C,1分で30〜40回増幅し、反応物をAgarose gel電気泳動、PAGE、Ethidium bromide染色により検出する方法を最適条件と決定した。
3.特異性の検討:RV標準株(RV-13)、RV国内分離株(UT-1,RT-2)、H-1それぞれの感染細胞を試料として、PCR法にて遺伝子増幅したところ、Primer Aではいずれの試料からも約370bpのDNA断片が増幅された。一方、Primer BではH-1、RV-13、UT-1で約260bpの断片が増幅されたが、UT-2では増幅が認められなかった。また、H-1に比較して、他の株では増幅の程度が弱い傾向がみられた。
4.感度の検討:H-1を用い、ウイルス感染価との比較を実施したところ、検体中の1.6〜2.3TClD_<50>のウイルスよりDNAの増幅および検出が可能であった。
今後は、マウス由来のMVMについても検討し、またVP-1領域内の特異配列をプロープとしてウイルス型別についても検討したい。さらに、継代腫瘍細胞のParvovirus汚染の摘発に本方法を応用したい。