哺乳動物脳のニューロフィラメントキナーゼの精製とその性質

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04833006
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 久永 眞市 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (20181092)
• Keywords: ニューロフィラメント / リン酸化 / キナーゼ / cdcキナーゼ / 中間径線維

Research Abstract

神経細胞に特異的な中間径繊維であるニューロフィラメントは、神経細胞内で最もリン酸化されている蛋白の一つである。しかし、ニューロフィラメントをリン酸化しているキナーゼについては全く解っていない。本研究では、脱リン酸化したNF蛋白を基質として、ブタ脳からニューロフィラメントのHサブユニット(NFH)を選択的にリン酸化するキナーゼを精製した。ブタ脳から微小管を重合させ、遠心分離したところ、ほとんどのNFHキナーゼ活性は微小管と共に沈澱分画に回収された。NFHキナーゼを微小管分画から高塩濃度溶液で抽出した後、DEAE、ハイドロキシアパタイト、硫安分画、Superose6によるゲルロ過、MonoQ、SPイオン交換の各カラムクロマトグラフィーを通すことにより高度に精製した。最終精製過程による活性とSDS-PAGEによる蛋白の挙動を調べることにより32Kと25Kの2つのサブユニットから成っていることが示された。NFHキナーゼはニューロフィラメントの3つのサブユニットのうち脱リン酸化されたNFHを最もよい基質とした。NFHのin vivoのリン酸部位に対する抗体を用いてブロッティングしたところ、NFHキナーゼによるリン酸化で、抗原性が回復し、NFHキナーゼがNFHのin vivoのリン酸化部位をリン酸化していることが示された。キナーゼの基質としてよく知られている蛋白をいくつか基質として調で、ヒストンH1がよい基質であることが解った。ヒストンH1キナーゼとして知られているcdc2キナーゼとの関連を調べたるため、抗PSTAIR抗体でブロッティングしたが、いずれのサブユニットにも反応しなかった。しかし、cdc2キナーゼと特異的に結合的に結合する酵母のsuc1蛋白とはcdc2キナーゼと同様に結合した。NFHKは神経細胞に特異的なcdc2に関連したキナーゼであると推測された。

Research Products

• [Publications] M.Takeuchi: "The 72-KDa microtubule-associated protein from porcine brain." J.Neurochem.58. 1510-1516 (1992)
• [Publications] M.Kusubata: "pl3^<SUC1> supresses the catalytic function of p13^<cdc2> Kinase for intermediate filament proteins,in vitro." J.Biol.Chem.267. 20937-20942 (1992)
• [Publications] S.Hisanaga: "Dephosphorylation of microtubule-binding sites at the neurofilament-H tail domain by alkaline,acid and protein phosphatases." J.Biochem.(1993)
• [Publications] S.Hisanaga: "Tau protein Kinase 2 has a similar characteristic to cdc2 Kinase for phosphorylating neurofilament proteins." J.Biol.Chem.(1993)
• [Publications] 久永 真市: "ニューロフィラメントのリン酸化とその機能." 神経研究の進歩. 36. 364-379 (1992)