心房性Na利尿ホルモン遺伝子の甲状腺ホルモン応答領域の同定に関する研究

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04833025
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 松原 弘明 関西医科大学, 医学部, 助手 (10239072)
• Keywords: 心房性ナトリウム利尿ホルモン / 甲状腺ホルモン応答領域 / 分子生物学 / 遺伝子

Research Abstract

1.ラットT_3aレセプター(rTR)のcDNAクローンの単離:報告されたrTRのcDNA配列をもとにPCR法を利用し約1KbのDNA断片を増幅しrandom primerを用い_<32>Pでラベルを行なった。これをプローブとしラット脳cDNAライブラリーよりcloningを行なった。4個のクローンが得られ rTRのcDNA全長を含むクローンをpcDNA発現ベクターに挿入した(pcD-rTR)。
2.ANF遺伝子のT_3応答領域(TRE)の決定:-2.4KbのANF上流域はchloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter geneに連結後pcD-rTRと伴にCos細胞にCaPO_4法により導入し48時間後CAT活性を測定した。上流域を持たないCAT gene(pO-CAT)に比較し約4倍の高いCAT活性を持った。甲状腺ホルモン(T_3:1μM)添加によりCAT活性はpO-CATに比べ約7倍上昇し、これは-2.4Kb内にTREが存在する事を示した。-2.4Kbの上流域は制限酵素認識部位を利用し-1.8Kb,-1.5Kb,-1.2Kb,-0.8Kb,-638まで連続的に短縮化しCAT geneに連結し上記と同様にCos細胞に導入しCAT活性を測定した。基礎CAT活性は-2.4Kbより-638bpまで有意に変化しなかった。またT_3添加によるCAT活性の増加も-2.4Kbより-638bpまで変化する事なく認められた。これはTREが-638bp内に存在する事を示す。-638bpより下流域には適当な制限酵素認識部位が存在しないため現在PCRを用いさらに短縮化した上流域を人工的に作製している。このDNA断片は塩基配列を確認後CAT geneに連絡しCos細胞に導入しTRE存在部位をさらに詳細に同定する予定である。