2004 Fiscal Year Annual Research Report
超音波を利用したin vitroおよびin vivoでの遺伝子導入の増強
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04F02550
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
田畑 泰彦 京都大学, 再生医科学研究所, 教授
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
HOSSEIN Hosseinkhani 京都大学, 再生医科学研究所, 外国人特別研究員
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| Keywords | 遺伝子導入 / 非ウィルス性遺伝子キャリア / ポリイオンコンプレックス / 3次元足場材料 / カチオン性水溶性高分子 / 細胞培養法 |
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| Research Abstract |
(1)非ウィルスベクターの創製
遺伝子は負電荷をもつアニオン性の高分子であり、細胞表面の負電荷との斥力により、そのままでは細胞内へ導入することはほとんど不可能である。本研究では、カチオン性高分子を用いて、遺伝子とポリイオンコンプレックスを形成させることによって、全体としての電荷を正しく、遺伝子の分子サイズを低下させ、細胞への遺伝子導入率の向上を試みた。まず、細胞との親和性の高い水溶性高分子である、ゼラチンあるいは細胞接着に関係するペプチド配列をもつプロネクチンFに対して、カチオン性のエチレンジアミンあるいはスペルミンを化学導入した。得られたカチオン化水溶性高分子と遺伝子との複合体について、表面電荷や分子サイズなどの物理化学的性質を調べたところ、期待通り、分子サイズが約200nmの正に帯電したポリイオンコンプレックスが形成されていることが分かった。
(2)細胞の接着環境および培養方法が遺伝子導入に与える影響
細胞の接着環境を変化させるために、異なる3種類の3次元足場材料を作製した。すなわち、ポリエチレンテレフタレート(PET)繊維からなる不織布、コラーゲンスポンジ、およびポリグリコール酸(PGA)繊維を用いてコラーゲンスポンジの力学的特性を改善したPGA-コラーゲン複合スポンジである。これらの3次元足場材料へ(1)で作製したカチオン化水溶性高分子と遺伝子とのポリイオンコンプレックスを含浸させることによって、遺伝子を坦持した3次元足場材料を得た。骨髄から単離した間葉系幹細胞(MSC)をこの足場材料内で培養したところ、MSCは増殖することが分かった。次に、 MSCに遺伝子-カチオン化ゼラチンコンプレックスを与え、培養したところ、MSCへの遺伝子導入が認められた。次に、あらかじめ、コンプレックスを坦持させた、3次元足場材料へMSCを播種した。通常の静置培養に加えて、旋回培養あるいは還流培養法で細胞を培養したところ、還流培養法が、他の培養法に比べて、遺伝子導入率、発現レベルの高いことが分かった。
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