リアルタイムPCRを用いた水媒伝染性植物病原菌の定量的検出

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04F04464
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 景山 幸二 岐阜大学, 流域圏科学研究センター, 教授
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): AHONSI O.Monday 岐阜大学, 流域圏科学研究センター, 外国人特別研究員
• Keywords: 水媒伝染性植物病原菌 / 水耕栽培 / 定量 / Pythium族菌 / PCR / 検出

Research Abstract

リアルタイムPCRのためのPythium helicoidesおよびPhytophthora nicotianaeに特異的なプライマーを設計するため、2つの方法から実験を進めた。ひとつは、種の分類によく使われるリボゾームDNAのITS領域の塩基配列をデータベースより入手し、アライメント分析からそれぞれの種に特異的塩基配列からプライマーを設計した。もうひとつは、RAPD法により増幅した種特異的バンドからプライマーを設計した。後者の方法では、当該種とともに近縁種のゲノムDNAを抽出し、10塩基配列程度の短いプライマーを用いてPCRにより任意にDNAを増幅した。次に、PCR産物を電気泳動して、バンドパターンを比較し、種に特異的なバンドを探索した。特異的バンドからDNAを抽出し、ベクターに連結後、大腸菌を形質転換し、ベクター中の挿入バンド由来の塩基配列を決定した。この塩基配列からプライマーを設計した。
リボゾームDNAのITS領域から設計したプライマーは、両種ともプライマー同士がアニーリングするプライマーダイマーの問題から、リアルタイムPCRには良いプライマーが設計できなかった。RAPD由来のプライマーについては、候補として数種類のプライマーを設計し、Phytophthora属菌及びその近縁属であるPhythium属菌に対する種特異性を検定した。その結果、それぞれの候補の内、各1組で種特異性がみられた。今後、このプライマーを用いてリアルタイムPCRによる定量が可能かどうか調べる。