siRNAライブラリーを用いたマイクロRNAの解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 04F04869
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 藁科 知子 (桑原 知子) 独立行政法人産業技術総合研究所, 器官発生工学研究ラボ, 研究員
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): SIERANT Malgorzata 独立行政法人産業技術総合研究所, 器官発生工学研究ラボ, 外国人特別研究員
• Keywords: siRNA / アルツハイマー病 / レンチウイルス / 神経 / 海馬 / 脳 / GFP / 遺伝子治療

Research Abstract

アルツハイマー病の発症メカニズムに深く関わるBeta Secretase遺伝子に対して、効率よく発現のノックダウンを誘導できるsiRNAの様々な設計を行った。設計したsiRNA中、in vitroの幹細胞培養系にて最も抑制効率の高かったsiRNAを、in vivoで効果を検証するためのレンチウイルスコンストラクトに組み込んだ。siRNA発現カセットが導入された感染細胞を識別するために、マーカーとしてGFPをともに発現する様に設計した。分化に影響を与えない緩衝液で懸濁され濃縮したウイルス液をコントロールとし、siRNAを発現するウイルスを、マイクロインジェクションによって神経新生が頻繁に起きる脳海馬領域に導入した。導入して2ヶ月経過後、脳を抽出し海馬領域の切片を作成し、siRNAが与える影響を各分化経路のマーカーとなる神経遺伝子や、グリア系遺伝子の多重染色を行い、評価した。さらに、脳領域での神経新生、前駆細胞の細胞増殖および成熟ニューロンへの分化誘導にBeta Secretase遺伝子がどのような役割を果たしているかも、関連するシグナル伝達系のキナーゼ群の活性化や幾つかの転写因子の発現、およびそれらのノックダウンを指標に、多重染色によって調べた。
これらの結果、設計し導入したsiRNAによって、どの標的遺伝子の場合も安定に脳内で起きていることをin vivoにおいても確認できた。また、同時に行ったシグナル伝達系のキナーゼのノックダウン細胞で、Beta Secretase遺伝子の発現抑制が見られた。これらは、アルツハイマー病の発症メカニズムに深く関わるBeta Secretase遺伝子が、健常体の動物の脳内で神経分化に深く関わる転写因子の制御機構によって、厳密に発現がコントロールされていることを示唆する。今後さらにこのメカニズムを深く追求し、遺伝子治療に向けて、より効率の良い標的遺伝子とノックダウンツールを研究開発して行く予定である。