1993 Fiscal Year Annual Research Report

陽イオンのポンプ分子内部における移動メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	05044027
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	谷口和弥北海道大学, 理学部, 教授 (40028204)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	J.M. Beachem バンダービルト大学, 医学部, 助教授 SVEN Mardh リンシェピング大学, 医学部生理化学部, 教授嘉屋俊二北海道大学, 理学部, 講師 (90186023)
Keywords	Na^+,K^+-ATPase / H^+,K^+-ATPase / イオン輸送ポンプ / ナトリウムポンプ / プロトンポンプ
Research Abstract	Na^+,K^+-ATPaseをBIPMとFITCとで2重標識した標品を用いて、リン酸化反応中間体(EP)の形成と分解(モ-ルド研究室)及び蛍光強度変化(ビ-チャム研究室)を追跡した。BIPMからFITCプローブへの蛍光エネルギー移動はNa^+結合酵素の状態を基準にとると、Na^+閉塞酵素で減少し、酢酸感受性リン酸化酵素(E_1P)で増加、K^+感受性リン酸化酵素(E_2P)で最大に達し、K^+結合酵素で減少、Na^+結合酵素基準値に戻ることが示された。本酵素標品を用い、ポリクロメーターによる各反応中間体と分解のプロセスの測定を行った。Na^+閉塞酵素にアセチルリン酸(Acp)を添加すると、BIPM蛍光励起によるBIPM蛍光の増加(5/s)とBIPMプローブからFITCプローブへのエネルギー移動によるFITC蛍光の増加(11/s)と減少(0.7/s)が観察された。FITCプローブの単独励起でも増加(5/s)と減少(0.05/s)が観察された。BIPM蛍光は増加と共にred shift、エネルギー移動に基づくFITC蛍光はわずかにblue shift、直接励起のFITC蛍光はred shiftした。両プローブ間距離をForsterの式を用いて計算した。その結果Cys-964に結合しているBIPMプローブからLys-510に結合しているFITCプローブ距離は約36Aと推定された。各反応中間体形成と分解に伴うプローブ間距離の変化は約1A以内と推定された。現在この距離の算定に用いて配向性因子の値が各中間体形成と分解に伴って変化するか否かを検討中である。 H^+,K^+-ATPaseをBIPMプローブで修飾すると反応中間体形成に伴い、Trp残基とは相を異にするBIPM蛍光の変化が観察された。又EP形成に伴いTrp残基からBIPMプローブへの蛍光エネルギー移動の増加が示された。BIPM結合部位の同定が現在進行中である。 H^+ポンプへのATP結合とAcpからのEP形成量及びATPからのEP形成量が2:2:1であることが示された。これはH^+ポンプが2量体でATPを加水分解していることを示している。

Research Products

(11 results)

All Other

All Publications (11 results)

[Publications] K.Taniguchi: "Changes in the fluorescence energy transfer accompanying formation of reaction intermediates in probe-labeled Na^+,K^+-ATPase in real time and the estimation of distance change between probes." Journal of Fluorescence. (in press). (1994)
[Publications] K.Taniguchi: "Changes in conformational state of probe labeled Na^+,K^+-ATPase in real time." The Sodium Pump. (in press). (1994)
[Publications] K.Taniguchi: "Estimation of distance changes between Cys-964 and Lys-501 in Na^+,K^+-ATPase intermediates." The Sodium Pump. (in press). (1994)
[Publications] S.Kaya: "Pyridoxal-5'-Phosphate probe at Lys 480 can monitor conformational events induced by acetyl phosphate in Na^+/K^+-ATPase." The Sodium Pump. (in press). (1994)
[Publications] A.Yamazaki: "Phosphorylation of Na^+,K^+-ATpase by p-nitro-phenylphosphate and other phosphatase sub-strates." The Sodium Pump. (in press). (1994)
[Publications] S.Kaya: "Pyridoxal-5'-phosphate probes at Lys480 can sence the binding of ATP and the formation of phosphoenzymes in Na^+,K^+-ATPase." Journal of Biological Chemistry. 267 (in press). (1994)
[Publications] Y.Nakamura: "Different susceptibility of phospholipase A_2 treatment of the fluorescence intensity changes in the vicinity of Cys-964 and Lys-501 in the α-chain of probe labeled Na^+,K^+-ATPase." Journal of Biochemistry. 115. 454-462 (1994)
[Publications] H.Eguchi: "The half and the full sites phosphorylation in H^+,K^+-ATPase shows paradoxical change in Trp fluorescence." Biochemical and Biophysical Research Communication. 196. 294-300 (1994)
[Publications] K.Taniguchi: "Conformation changes of probe labeled Na^+,K^+-ATPase in real time." Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 374. 556 (1993)
[Publications] Y.Adachi: "Na^+,K^+-ATPase based bilayer lipid membrane sensor for adenosine 5'-triphosphate." Analytical Chemistry Acta. 281. 577-584 (1993)
[Publications] K.Taniguchi: "Reversible changes in the fluorescence energy transfer accompanying formation of reaction intermediates in probe-labeled Na^+,K^+-ATPase." Journal of Biological Chemistry. 268. 15588-15594 (1993)

1993 Fiscal Year Annual Research Report

陽イオンのポンプ分子内部における移動メカニズムの解明

Principal Investigator

谷口 和弥 北海道大学, 理学部, 教授 (40028204)

Research Products

[Publications] K.Taniguchi: "Changes in the fluorescence energy transfer accompanying formation of reaction intermediates in probe-labeled Na^+,K^+-ATPase in real time and the estimation of distance change between probes." Journal of Fluorescence. (in press). (1994)

[Publications] K.Taniguchi: "Changes in conformational state of probe labeled Na^+,K^+-ATPase in real time." The Sodium Pump. (in press). (1994)

[Publications] K.Taniguchi: "Estimation of distance changes between Cys-964 and Lys-501 in Na^+,K^+-ATPase intermediates." The Sodium Pump. (in press). (1994)

[Publications] S.Kaya: "Pyridoxal-5'-Phosphate probe at Lys 480 can monitor conformational events induced by acetyl phosphate in Na^+/K^+-ATPase." The Sodium Pump. (in press). (1994)

[Publications] A.Yamazaki: "Phosphorylation of Na^+,K^+-ATpase by p-nitro-phenylphosphate and other phosphatase sub-strates." The Sodium Pump. (in press). (1994)

[Publications] S.Kaya: "Pyridoxal-5'-phosphate probes at Lys480 can sence the binding of ATP and the formation of phosphoenzymes in Na^+,K^+-ATPase." Journal of Biological Chemistry. 267 (in press). (1994)

[Publications] Y.Nakamura: "Different susceptibility of phospholipase A_2 treatment of the fluorescence intensity changes in the vicinity of Cys-964 and Lys-501 in the α-chain of probe labeled Na^+,K^+-ATPase." Journal of Biochemistry. 115. 454-462 (1994)

[Publications] H.Eguchi: "The half and the full sites phosphorylation in H^+,K^+-ATPase shows paradoxical change in Trp fluorescence." Biochemical and Biophysical Research Communication. 196. 294-300 (1994)

[Publications] K.Taniguchi: "Conformation changes of probe labeled Na^+,K^+-ATPase in real time." Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 374. 556 (1993)

[Publications] Y.Adachi: "Na^+,K^+-ATPase based bilayer lipid membrane sensor for adenosine 5'-triphosphate." Analytical Chemistry Acta. 281. 577-584 (1993)

[Publications] K.Taniguchi: "Reversible changes in the fluorescence energy transfer accompanying formation of reaction intermediates in probe-labeled Na^+,K^+-ATPase." Journal of Biological Chemistry. 268. 15588-15594 (1993)

谷口和弥北海道大学, 理学部, 教授 (40028204)