ヒト好中球のスーパーオキサイド産生酵素-その分子構造と活性誘導の機構-

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05044181
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 田村 実 愛媛大学, 工学部, 助教授 (00128349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): LAMBETH J.D. アメリカ合衆国, エモリー大学・医学部, 教授
• Keywords: 好中球 / 活性酵素 / スーパーオキサイド / G protein / Cross-linking / NADPH oxidase / 貧食作用 / アクチン

Research Abstract

NADPH oxidaseのサブユニット構造を解明するために,セミリコンビナント系(遺伝子工学で得られたp47,p67,及びracと形質膜画分からなる再構成系)で本酵素を活性化し、これを開裂可能な架橋剤で固定したのち電気泳動し,ついで架橋を開裂させてから二次元目の電気泳動を行い,Western blotを行った。その結果,架橋複合体は大部分が分子量の相当大きな分子になっており,ポリアクリルアミドゲルに入って行くものはごく一部であることが明らかになった。したがって複合体の構造を解析するためにはよりマイルドな条件下で架橋することが望まれた。また架橋による安定化は細胞質ゾルを使う系と比べると不十分で,これについても検討が必要となった。ところが,このような検討にはリコンビナント蛋白が多量にいることから,上述の三種の細胞質因子を多量に調製する必要が生じた。そこで本年は先ずrac蛋白の大量発現(大腸菌)と精製を試み,かなりの量の精製タンパクを得ることに成功した。残るp47,p67については昆虫細胞を使う方法をLambeth研究室から修得し,我々自身の手で生産するべく,現在進行中である。
一方、これとは別に,細胞質タンパクの供給源として細胞質ゾルを用いた方法で架橋と解析を行った。この場合,複合体がさらに大きな分子(分子量200万以上の超高分子)になっていることが明かになった。近年,好中球の活性化と平行してアクチンが重合することが言われており,上述の超高分子ができる理由として活性複合体と重合アクチンが会合していることが考えられた。そこで本酵素の活性化(あるいは活性の保持)にアクチンが関与しているかどうかを検討した。その結果,活性化した酵素の活性保持に重合アクチンが重要な役割を果している事を示す実験データを得た。今後はこの点(アクチンの重合)も考慮に入れながら研究を進め,酵素の構造を明らかにしたい。

Research Products

• [Publications] 田村実: "ヒト好中球NADPHオキシダーゼの無細胞活性化に及ぼすスペルミン影響" 生化学. 66. 652 (1994)
• [Publications] Minoru Tamura: "Phosphatidic Acid-induced Superoxide Generation in Electro-permeabilzed Human Neutrophils" Arch.Biochem.Biophys.305. 477 (1993)
• [Publications] 田村実: "ホスファチジン酸によるヒト好中球スーパーオキサイド産生の誘起" 生化学. 65. 944 (1993)