1993 Fiscal Year Annual Research Report

好熱菌PS3のH^+(Na^+)/アラニンシンポーターの分子機構

Research Project

Project/Area Number	05252230
Research Institution	Himeji Institute of Technology
Principal Investigator	平田肇姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)
Keywords	アラニン能動輸送 / Na^+シンポーター / 活性発現 / プロモーター / 挿入配列
Research Abstract	好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42,500Daの単一ポリペプチドからなり、H^+あるいはNa^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるH^+(Na^+)/基質(アラニン、グリシン、セリン)シンポーターである。昨年までにACP遺伝子をクローニングし、その全構造を決定した。今回は大腸菌のアラニン、グリシン輸送欠損株RM1を用いてACPの機能発現を試みた。これまでにクローニングされているACP遺伝子のORFとその上流120bpを含むHindIII-SalIの約1.5KbpフラグメントをpUC119に組み込んだプラスミドを作製し、大腸菌アラニン、グリシン輸送欠損株RM1(MacLeod博士より分与)に導入し、^<14>C-アラニンあるいは^<14>Cグリシン輸送活性を測定したがいずれも活性は見られなかった。したがって、ACP遺伝子のプロモーター領域はこのフラグメントには含まれていないことが考えられた。そこでこのプロモーター領域を検索するため、HindIPI-EcoRIの約500bpのフラグメントをプローブとして上流約2.2KbpをクローニングしACP遺伝子につなげたのちにベクターpBR322へ組み込んだプラスミド(pAC5629)を作製し上記RM1に導入し(RM1(pAC5629))、この株について^<14>C-アラニンあるいは^<14>C-グリシン輸送活性を測定したところ非常に強い輸送活性を示し、少なくともACP遺伝子ORFの上流2.2Kbp部分にプロモーター活性が存在することが明らかになった。また、RM1(pAC5629)におけるACPタンパク質の発現は抗ACPポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認された。また、輸送の速度論的解析を行ったところ、L-アラニンに対するKtは11muM、グリシンに対するKtは6muMとなり、これらはいずれも精製ACPのプロテオリポソーム再構成系でのKt値とよく一致した。さらに、対照として用いた大腸菌K12株の^<14>C-グリシンの輸送活性の至適温度35℃付近であったが、RM1(pAC5629)株においては至適温度は45℃付近と明らかな好熱性を示した。このようにACP遺伝子ORFの上流2.2Kbpの領域にプロモーターが存在することが明らかとなったが、この部分の塩基配列を調べたところ藻Anabena sp.の挿入配列(Insertion sequence、IS)と非常に高いホモロジースコアを示し、しかもACPはこのISを含まなければほとんど発現しないことが解った。このことはACPとISはポリシストロニックな転写、すなわちオペロンを形成していることを示唆しており、現在プロモーター領域の決定とISの役割について解析を進めている。

Research Products
(8 results)

All Other

All Publications (8 results)

[Publications] Matusda,C.: "Tissue-specific lsoforms of the Bovine Mitochondrial ATP Synthase gamma-subunit." FEBS Lett.325. 281-284 (1993)
[Publications] Muneyuki,E.: "Inhibitory Effect of NaN3 on the FoF1 ATPase of Submitochondrial Particles as related to Nucleotide Binding." Biochim.Biophys.Acta. 1144. 62-68 (1993)
[Publications] Nakanishi,M.: "Solubilization and Reconstitution of High-and Low-affinity Na^+-dependent Neutral L-alpha-Amino Acid Transporters from Rabbit Small Intestine." Biochim.Biophys.Acta. 1151. 193-200 (1993)
[Publications] Muneyuki,E.: "Direct Transmembraneous Reconstitution of Bacteriorhodopsin into Planar Phospholipid Bilayers." Biochim.Biophys.Acta. 1183. 171-179 (1993)
[Publications] Kamata,H.: "Amphiphilic Peptides Enhance the Efficiency of Liposome-mediated DNA Transfection." Nucleic Acids Researh. 22. 536-537 (1994)
[Publications] Nakanishi,M.: "Purification and Reconstitution of an Intestinal Na^+-dependent Neutral Amino Acid L-alpha-Amino Acid Transporter." J.Biol.Chem.(in press). (1994)
[Publications] 平田肇: "日本膜学会編〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第2章生体膜構成成分の分離・分析法アミノ酸キャリヤー" 共立出版, 6 (1993)
[Publications] 平田肇: "日本膜学会編〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第3章生体膜の機能的再構成平面膜" 共立出版, 10 (1993)

1993 Fiscal Year Annual Research Report

好熱菌PS3のH^+(Na^+)/アラニンシンポーターの分子機構

Principal Investigator

平田 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)

Research Products

[Publications] Matusda,C.: "Tissue-specific lsoforms of the Bovine Mitochondrial ATP Synthase gamma-subunit." FEBS Lett.325. 281-284 (1993)

[Publications] Muneyuki,E.: "Inhibitory Effect of NaN3 on the FoF1 ATPase of Submitochondrial Particles as related to Nucleotide Binding." Biochim.Biophys.Acta. 1144. 62-68 (1993)

[Publications] Nakanishi,M.: "Solubilization and Reconstitution of High-and Low-affinity Na^+-dependent Neutral L-alpha-Amino Acid Transporters from Rabbit Small Intestine." Biochim.Biophys.Acta. 1151. 193-200 (1993)

[Publications] Muneyuki,E.: "Direct Transmembraneous Reconstitution of Bacteriorhodopsin into Planar Phospholipid Bilayers." Biochim.Biophys.Acta. 1183. 171-179 (1993)

[Publications] Kamata,H.: "Amphiphilic Peptides Enhance the Efficiency of Liposome-mediated DNA Transfection." Nucleic Acids Researh. 22. 536-537 (1994)

[Publications] Nakanishi,M.: "Purification and Reconstitution of an Intestinal Na^+-dependent Neutral Amino Acid L-alpha-Amino Acid Transporter." J.Biol.Chem.(in press). (1994)

[Publications] 平田肇: "日本膜学会編 〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第2章生体膜構成成分の分離・分析法アミノ酸キャリヤー" 共立出版, 6 (1993)

[Publications] 平田肇: "日本膜学会編 〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第3章生体膜の機能的再構成平面膜" 共立出版, 10 (1993)

平田肇姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)

[Publications] 平田肇: "日本膜学会編〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第2章生体膜構成成分の分離・分析法アミノ酸キャリヤー" 共立出版, 6 (1993)

[Publications] 平田肇: "日本膜学会編〓膜学実験シリーズ第1巻生体膜編〓第3章生体膜の機能的再構成平面膜" 共立出版, 10 (1993)