大腸菌蛋白質膜透過系のキーエンザイムSecAの構造と機能

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05268214
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 徳田 元 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教授 (40125943)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松山 伸一 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (50183108)
• Keywords: 蛋白質膜透過 / SecA / 大腸菌 / ATPase / 再構成系

Research Abstract

大腸菌の蛋白質膜透過系において、中心的役割を果たしているのが膜表在性のSecA蛋白質である。SecAは蛋白質膜透過が阻害を受けると、その存在量が10倍以上に増加することが知られている。SecAには、膜透過型前駆体蛋白質と結合する活性があり、シャペロン様蛋白質とも考えられている。正常細胞ではSecA蛋白質が自身の発現のリプレッサーとなっていると考えられている。しかし、蛋白質膜透過系に欠陥が生じると、どういう機構でリプレッサーとして機能しなくなるかについては不明である。これらの点を明らかにするためには、SecAの構造と機能の詳細な解明が必要である。本研究は、SecAの構造と機能を明らかにするために、変異SecAの作成とその機能解析を行い以下の成果を得た。
(1)ヒスチジン残基を化学修飾したSecAは、蛋白質膜透過活性が阻害されることを明らかにした。
(2)SecAの重要な機能はN-末端に局在している。この領域にPCR法でランダムに変異を起こさせた。
(3)変異SecA(プラスミド)の発現が野生型SecA(染色体)の機能を阻害する結果生育阻害を示す変異SecAを分離精製した。
(4)in vitro膜透過実験系で変異SecAの機能を解析した結果、すべての変異体が膜透過活性を失っており、また野生型SecAの機能を競争的に阻害することを見いだした。
(5)変異SecAの3種についてどの部位に変異が生じているかを明らかにし、機能に重要なアミノ酸残基を同定した。

Research Products

• [Publications] Kawasaki,S.: "Membrane vesicles containing overproduced SecY and SecE exhibit high translocation ATPase activity and counter movement of protons in a SecA-and presecretory protein-dependent manner." J.Biol.Chem.268. 8193-8198 (1993)
• [Publications] Nishiyama,K.: "A novel membrane protein involved in protein translocation across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli." EMBO J.12. 3409-3415 (1993)
• [Publications] Matsuyama,S.: "SecD is involved in the release of translocated secretory proteins from the cytoplasmic membrane of Escherichia coli." EMBO J.12. 265-270 (1993)
• [Publications] Tokuda,H.: "Histidine residues are involved in translocation-coupled ATP hydrolysis by the SecA Protein." Biochem.Biophys.Res.Commun.192. 1415-1421 (1993)
• [Publications] 徳田 元: "大腸菌蛋白質分泌の分子機構" 蛋白質,核酸,酵素. 38. 947-956 (1993)
• [Publications] 徳田 元: "大腸菌における分泌型蛋白質の細胞質膜透過系" “Annual Review細胞生物学1993(矢原、御子柴、月田編)"中外医学社. 37-48 (1993)
• [Publications] 徳田 元: "タンパク質の細胞内輸送" “最新生体膜システム(水島,宇井編)"講談社. 61-69 (1993)