Crohn病における疾患特異的腸管蛋白とMycobacteriaに関する研究-特に遺伝子工学的手法を用いて-

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05404029
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 吉田 豊 弘前大学, 医学部, 教授 (80003375)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 元春 弘前大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 芳賀 陽一 弘前大学, 医学部, 助手 (20261448) ; 村田 有志 弘前大学, 医学部・附属病院, 講師 (70174307)
• Keywords: Crohn病 / 腸管特異蛋白 / cDNAクローニング / モノクローナル抗体 / PCR / Mycobacteria / 麻疹 / 真菌

Research Abstract

1.CD腸管特異蛋白cDNA、ゲノムDNAのクローニング
CD腸管から抽出したRNAよりmRNAを溶出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。Dasらの方法に準じ粗蛋白を精製したが、ウェスタンブロットによる検索では粗蛋白がCD腸管に特異的ではないと判明し、スクリーニングに用いることは不可能であった。そのため健常腸管から抽出したmRNAに前述のcDNAをアニールさせ、ハイブリダイズしなかったcDNAを抽出(サブトラクション)した。このプローブを用いてライブラリーをスクリーニングし、塩基配列の決定を行っているが、今のところ特異的なクローンは得られていない。またスクリーニングの効率を高める目的で、疾患特異的なモノクローナル抗体を作製中であるが、未だに特異的なものは得られていない。
2.CD腸管におけるMycobacteria、真菌およびウィルスの検出とその特異性の検討
CD,UC,対照の腸管組織の生検、手術標本からDNAおよびRNAを抽出した。DnaJ遺伝子由来のプライマーはMycobacteriaに特異的ではない可能性が示唆されたため、M.paratuberculosis(M.PTB)に特異的なプライマーを作成し、Nested PCRを行った。アガロース電気泳動では特異的な産物は得られず、M.PTBのCDへの関与は否定的と考えられたが、さらにサザンブロッティングも併用して感度、特異性を高め確認中である。また分離される微生物が二次的なものか否かを検討するため、Mucor racemosis,Sacchromyces cerevisiae,Candida albicansなどの真菌や麻疹、ムンプス、風疹ウィルスを認識するプライマーを作成し、Nested PCRやNested RT-PCRで検討した。真菌類についてはコントロールとの有意差がなく2次的な関与が示唆された。麻疹、ムンプス、風疹ウィルスについては特異的な産物は得られず、病因としての関与は否定的と考えられた。