C型肝炎ウイルス遺伝子導入モデルによる肝炎発症機序および肝発癌機構の解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05404030
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 鎌田 武信 大阪大学, 医学部, 教授 (80028399)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三田 英治 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 竹原 徹郎 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 片山 和宏 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 笠原 彰紀 大阪大学, 医学部, 助手 (70214286) ; 林 紀夫 大阪大学, 医学部, 講師 (00144478)
• Keywords: C形肝炎ウィルス / in vivo遺伝子導入 / リポソーム / PCR / 免疫組織化学 / Lac Z / 肝炎 / 肝癌

Research Abstract

HCVの肝細胞障害発生機序および肝癌発生機序を解明するにはin vivoでのHCV発現モデルを作成することが必要である。本年度はリポソーム法を用いたin vivo遺伝子導入法によるラット肝でのHCV遺伝子の発現についての検討を行った。5'非翻訳領域を削ったHCVの全遺伝子配列を発現ベクターのβアクチンプロモーターの下流に挿入し、またレポーター遺伝子として大腸菌LacZ遺伝子を同様に挿入した。これらの発現ベクターをリポソームと混合し、これを6週令のSD雄性ラットの総胆管より肝内に注入した。LacZ遺伝子の発現ベクターを注入したラットでは、X-Ga1を用いた組織染色により、0.1%前後の肝細胞にβガラクトシダーゼの発現が見られた。この発現は遺伝子の注入後1日目より認められたが、7日後には消失しており、このシステムによる遺伝子発現は一過性であった。HCVの発現については、HCVの全遺伝子配列の発現ベクター注入2日後に肝を摘出し、RNAレベルの遺伝子発現をPCR法を用いて、またHCVコア蛋白の発現を免疫組織染色により検討した。肝より抽出した総RNAをDNaseI処理したものをサンプルとして、コア領域およびNS5領域に設定した2対のプライマーを用いてRT/PCRを行うと、それぞれ特異的な陽性バンドが検出されたが、同じサンプルを用いてRTを行わずにPCRのみを行うとこのバンドが検出されなかった。したがって、ラット肝内で発現ベクターに挿入されたHCVcDNAからRNAへの転写が行われていることが確認された。またマウスモノクロナルHCVコア抗体を用いて肝組織を酵素抗体法により染色すると、肝細胞質に顆粒状のDABの発色が認められた。今後、このHCV発現モデルを用いて、肝細胞障害の有無について検討していく予定である。

Research Products

• [Publications] Yuki N.et al.: "Changes in antibodies to specific hepatitis C virus antigens with interferon alpha therapy" American Journal of Gastroenterology. 88. 914-918 (1993)
• [Publications] Oshita, M.et al.: "Prevalence of hepatitis C virus in family members of patients with hepatitis C" Journal of Medical Virology. 41. 251-255 (1993)
• [Publications] Hagiwara, H.et al.: "Quantitation of hepatitis C virus RNA in serum of asymptomatic blood donors and patients with type C chronic liver disease" Hepatology. 17. 545-550 (1993)
• [Publications] Yuki N.et al.: "Quantitative analysis of antibodies to hepatitis C virus during interferon alpha therapy" Hepatology. 17. 960-965 (1993)
• [Publications] Hagiwara, H.et al: "Quantitative analysis of hepatitis C virus RNA in serum during interferon therapy" Gastroenterology. 104. 877-883 (1993)
• [Publications] Haruna Y.et al.: "Detection of hepatitis C virus RNA in liver tissues by an in situ hybridization technique" Journal of Hepatology. 18. 96-100 (1993)