1994 Fiscal Year Annual Research Report
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05404073
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| Research Institution | HOKKAIDO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
森岡 弘志 北海道大学, 薬学部, 助手 (20230097)
岩井 成憲 北海道大学, 薬学部, 助手 (10168544)
井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助教授 (80088856)
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| Keywords | 紫外線損傷DNA / チミンダイマー / PCRクローニング / シングル鎖抗体 / フレキシブルリンカー |
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| Research Abstract |
1)チミン2量体(チミンダイマー)を含むDNA断片の合成
適当な保護機を導入したチミジン2量体に紫外線照射を行った後,3'-ホスホアミダイト体とすることによりチミンダイマーを含んだ結合ユニットとした.チミンダイマーを含んだオリゴヌクレオチド(dGCGGTTGGCG)をこの結合ユニットを用いてDNA合成機により大量合成した.また,相補鎖(dCGCCAACCGC)を合成した.
2)チミンダイマー認識抗体の可変領域(Fv)遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
マウス抗体Fv遺伝子配列のデータベースをもとにして,可変領域H鎖(V_H)及び(V_L)遺伝子のそれぞれの5'側および3'側にプライマーを設計した.紫外線損傷DNA認識抗体を産生するハイブリドーマ細胞から,PCR法によってV_HおよびV_L遺伝子をクローニングし,塩基配列を決定した.
V_HおよびV_L両遺伝子を(Gly_4-Ser)_3というアミノ酸配列を持つフレキシブルリンカー部分の遺伝子(鎖長52merの2本のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたもの)を介して,T4DNAリガーゼにより結合させ,scFv遺伝子を得た.
3)scFv遺伝子の大腸菌内での発現とscFvの精製
scFv遺伝子をT7ファージRNAポリメラーゼのプロモーターを持つ発現ベクターに組み込み,大腸菌中で発現させ,scFvの精製を行いSDSゲルクロマトグラフィーで単一バンドを示すscFvを得た.
4)scFvと損傷DNAとの結合
上記のscFvは損傷DNA断片と結合することを確認した.
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