酵母菌をモデルとした真核細胞染色体DNA複製機構の分子生物学的、分子遺伝学的研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05404083
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 杉野 明雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90231737)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川崎 泰生 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (30243257) ; 荒木 弘之 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (20151160)
• Keywords: 真核細胞染色体DNA複製 / 出芽酵母 / DNAポリメラーゼ / DNAヘリカーゼ / DNAポリメラーゼ補助因子 / In vitro DNA複製 / 蛋白精製 / クローニング

Research Abstract

1)DNA helicase III遺伝子の単離及び染色体DNA複製における働き
出芽酵母より新しく開発したin vitro ARS plasmid複製系を5-10倍促進するDNA helicase IIIをほぼ純品にまで精製し、その生化学的性質を詳細に研究した。このDNA helicaseは一本鎖DNA上を5'→3'方向に移動し二本鎖DNAを卷戻す。このDNA helicaseが実際染色体DNA複製に関与しているか検証するために、精製した蛋白の部分アミノ酸配列を決定し、それをもとに遺伝子の単離を行った。単離した遺伝子は第五番染色体右腕のテロミアに近い所に位置し、1121アミノ酸残基よりなるORF(予想分子量127KDa)を持ち、helicase supper familyに特徴的モチーフも有することが明らかになった。このORFを欠失した酵母変異株を作製したが、顕著な表現型は示さなかった。しかし酵母染色体DNAを用いたSouthern hybridizationの結果、DNA helicase IIIのhomologが存在することが明らかになり、このhomologが細胞内でDNA helicase IIIの代わりをしている可能性が非常に高いことが判明した。現在このhomologの遺伝子のクローニングを行っている。
2)染色体DNA複製開始蛋白の同定及び精製
酵母染色体DNA複製開始部位を持つARS1 DNA断片を含む二本鎖環状DNAを酵母DNA polymerase I(α)-primase複合体、yRFA,DNA helicase IIIと大腸菌DNA gyraseの存在下で(rNTPsとdNTPsも含む)保温するとARS1に依存したDNA合成がde novoに起こり、leading鎖及びlagging鎖の両方が合成される。この系からDNA gyraseを除くと殆どDNA合成が起きない。そこでこの不活性化したin vitro系を用い、DNA gyraseと同様の働きをする酵母蛋白の同定と精製を試みたが不成功であった。一方、酵母核抽出液より大腸菌DNA gyraseを加えることなくde novoにDNA合成を開始できる系を開発した。しかしこの系には十分量のDNA polymerase I-primaseが存在しないので、外から精製したDNA polymerase I-primaseを補充しなければならない。この新しい系はin vivoと同じようにleading鎖、lagging鎖が等量ずつ合成され(ladding鎖は100-150nucleotideの大きさのDNA-RNAが、leading鎖は長いDNAが合成される)うまくin vivoの複製様式を反映していると考えられる。
3)DNAポリメラーゼ補助因子の精製
出芽酵母染色体DNA複製に必須なDNAポリメラーゼI,II及びIIIはそれ自体ではDNA合成をうまく行うことはできない。DNA合成を効率よく、正確に行うためには、各々のDNAポリメラーゼと複合体を形成しているDNAポリメラーゼ補助因子が必要である。DNAポリメラーゼII及びIIIの補助因子であるRF-C蛋白複合体の1つのサブユニットであるRFC2遺伝子のクローニングを行い、その遺伝子産物を大量発現・精製し、生化学的性質を明らかにした。

Research Products

• [Publications] Kikuo Shimizu: "Purification and characterization of DNA helicase III from the yeast Saccharomyces cerevisiae" Journal of Biological Chemistry. 268. 9578-9584 (1993)
• [Publications] Kikuo Shimizu: "Purification and characterization of a new DNA polymerase from budding yeast Saccharomyces cerevisiae" Journal of Biological Chemistry. 268. 27148-27153 (1993)
• [Publications] Alan Morrison: "The 3'→5' exonucleases of both DNA polymerases δ and ε participate in correcting errors of DNA replication in Saccharomyces cerevisiae" Molecular and General Genetics. (印刷中). (1994)