抗体触媒およびリパーゼの高度機能改変と物質生産への応用

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05453167
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 博章 京都大学, 化学研究所, 助手 (90204487) ; 平竹 潤 京都大学, 化学研究所, 助手 (80199075)
• Keywords: エステル加水分解 / 抗体触媒 / 活性アルギニン残基 / 生成物阻害 / 触媒性残基 / Pseudomonas属リパーゼ / 巻き戻しタンパク質 / リパーゼ活性化

Research Abstract

平成5年度は以下の2点について研究を行なった。
1.エステル加水分解を触媒する抗体の触媒機構と生成物阻害の軽減、および触媒性残基の導入
エステルを加水分解する活性のあるモノクローナル抗体を、遷移状態アナログをハプテンとして誘導し、その諸性質を明らかにした。化学修飾の結果、抗体の結合部位にあるアルギニン残基1個が活性に必須であるばかりでなく、その活性アルギニン残基と生成物カルボン酸との静電的相互作用が生成物阻害の原因であることをつきとめた。そこで、反応と同時に脱炭酸し、生成物の負電荷が自動的に消失するような基質である炭酸エステルを用いて反応を行なったところ、予想通り抗体の結合部位あたり100回以上のターンオーバーが観測され、触媒的に反応が進行することが確かめられた。また、抗体の結合部位に、一般塩基触媒として作用するカルボキシル基を導入し、抗体の触媒活性とターンオーバーの両方を向上させる試みとして、リン酸エステルのα位にアミノ基を持ったハプテンを合成し、これを用いてモノクローナル抗体を誘導した。このハプテンに対し特異的に結合する抗体が多数得られたが、エステル加水分解活性を持った抗体はまだ得られていない。さらにマウスの免疫とスクリーニングを繰り返す予定である。
2.Pseudomonas属リパーゼの大量発現と、巻戻しタンパク質によるリパーゼの活性化
Pseudomonas属リパーゼをコードする遺伝子を高発現プロモーターに接続し、大陽菌で大量発現させる系を確立した。しかし生産されたリパーゼはペプチド鎖が正しく折りたたまれず、不活性な封入体を形成した。いっぽう、リパーゼ遺伝子のすぐ下流にある、未知のタンパク質をコードする遺伝子を同じく大陽菌で大量発現させ遺伝子産物を単離することに成功した。この遺伝子産物はin vitroで先ほどの不活性なリパーゼを正しく巻戻し、活性型のリパーゼに変える働きがあることがわかった。リパーゼの巻戻しには等モルの巻戻しタンパク質を必要とし、ATPを必要としないなどの点で、従来から知られているシャペロンとは異なるタンパク質であることが示唆された。