時間分解共鳴ラマン分光法によるタンパク質の速い構造変化の検出

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05453212
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 北川 禎三 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 教授 (40029955)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小倉 尚志 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 助手 (70183770)
• Keywords: 共鳴ラマン / 時間分解ラマン分光 / チトクロム酸化酵素 / ミオグロビン / タンパク質ダイナミクス

Research Abstract

酵素が示す特異的反応性は、反応中心における触媒活性に加えて、それをとりまくタンパク質の合目的的な構造変化が重要である。未反応の基質を取り込み、生成物を放出するメカニズムがあって初めて酵素は繰り返し反応できる。その役割を担うのがタンパク質部分であり、それはかなり速いコンフォメーション変化を含む。本研究では呼吸系において酸素を水に変える酵素であるチトクロム酸素酵素と、酸素貯蔵タンパクであるミオグロビンの反応中間体を時間分解共鳴ラマン分光法で追跡した。ウシ心筋チトクロム酸化酸素と一酸化炭素との複合体をレーザー光で光解離させることによりO_2との反応をスタートさせ、a_3ヘムに結合するO_2に4個の電子を伝達していった各段階における共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素同位体でシフトするバンドを調べ、Fe^<iii>-O_2→Fe^<III>-O-O-H→Fe^<IV>=O→Fe^<III>-OHと変化していくことを初めて確立し、本酵素の60年間に及ぶ研究の歴史にグレークスルーを作った。ミオグロビンの分子構造はdeoxy型もoxy型も1.5Å分解能のX線結晶解析で明らかにされているが、そのいづけにおいてもO_2がタンパクの外側からヘム鉄に到達する道筋が存在しない。リガンドの脱着にともなうタンパクの速い構造変化をナノ秒のポンプ/プローブ時間分解ラマン分光法で追跡した。リガンドとして一酸化炭素を用いた。COはサブピコ秒で光解離し、100ナノ秒からミリ秒にかけ再結合する。再結合したもののFe‐CO伸縮振動を観測するシステムを組立て、まずヒトミオグロビンとその遠位ヒスチヂン変異株6種について上記の測定をした。遠位ヒスチヂンの置換により静的なFe‐CO伸縮振動は490〜510cm^<-1>と変化し、490cm^<-1>付近のものの再結合は510cm^<-1>のものより非常に速かった。しかし再結合途中で、いわゆるオープン形に対応するバンドは観測されなかったので、新しい理論モデルの構築が必要なことがわかった。クジラミオグロビンで同種の実験を試みつつある。

Research Products

• [Publications] T.Ogura.S.Takaheshi,S.Hirota,K.Shinzawa,S.Yoshikawa,T.Kitagawa: "Time‐Rasdved Resonance Raman,Elucidarion of the Pathway for Dioxyyen Reduction by Cytochrome c Oxidase" Journal of the American chenical Society. 115. 8527-8536 (1993)
• [Publications] Y.Sakan,T.Ogur,T.Kitagawa,F.A.Fraunifelter,R.Mattera,M.Ikeda: "Time‐Resdved Resonance Raman Study on the Binding of Carbon Monokede to Recombinent Human Myoglobin and its Distal Histidine Mutants" Biochemistry. 32. 5815-5824 (1993)
• [Publications] S.Takahashi,J.S.Ahn,s.asaka T.Kitagawa: "Multichannel Fourier Transtorm Spectroscopy Using Two‐Dinensional Detection of the Itorferogram and Its Application to Raman Spectroscopy" Applied Spectroscopy. 47. 863-868 (1993)