1994 Fiscal Year Annual Research Report
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05454113
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
小野寺 良次 宮崎大学, 農学部, 教授 (60040862)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富田 純史 宮崎大学, 農学部, 助教授 (70113230)
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| Keywords | ルーメンプロトゾア / cDNAライブラリー / ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素 / Entodinium caudatum / E.caudatum 山羊 / mRNA / RNA / lysAジーン |
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| Research Abstract |
平成6年度は、平成5年度の遅れを取り戻し、さらに、当初の目的である塩基配列の決定までもっていくように鋭意努力した。第一段階として、実施計画に記したように、山羊ルーメン内で増殖させているEntodinium caudatum約5mlを集め、それからキットISOGEN(日本ジーン社)により全RNAを集めた(64.8mg/ml)。続いて、Poly(A) Quick Kit Push Columns (Stratagene 社)により真核生物すなわち、この場合、ルーメンバクテリアのRNAを含まないE.caudatumのmRNAのみを集めた。結果的に、E.caudatum 1ml当たり124μgのmRNAを得ることができた。また、RNAの電気泳動でもはっきりとmRNAのバンドを確認できた。ちなみに、混合プロトゾアからは153μgを得た。次に、得られたmRNAよりZAP-cDNA Synthesis kit(Stratagene 社)を用いて、cDNAを合成した。これをλZAPIIファージベクターに連結し、cDNAライブラリーとした。これをX-galの入った培地にE.coliとともに塗布し、青白判別によりlac Z遺伝子にcDNAが挿入されたかどうかを確認した結果、多くのコロニーが白色を示したので、cDNAライブラリーが確実に作成されていることが明らかになった。続いて、lysAジーンのスクリーニングの段階となり、検討した結果、当初予定のホモロ-ガスな方法では、経費の割に失敗も多いことを知り、バクテリアの先例に倣い、lysAジーンをもたないE,coli変異株にcDNAを挿入したプラスミド(pBluescript)を導入し、形質転換をさせ、リジンを含まない培地での増殖性によって判定する方法に変更することにしたので、変異株の購入などに時間を要している。その間、スクリーニングの容易なアミラーゼとキチナーゼ遺伝子をスクリーニングし、遺伝子の存在を確認した。平成7年度は、上記の方法で、あるいは他の方法も駆使し、cDNA中のlysAジーンの塩基配列を決めたい。
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[Publications] Amin,M.Ruhul: "Rapid determination of phenylalanine and its related compounds in rumen fluid by high-performance liquid chromatography" Journal of Chromatography A. 663. 201-207 (1995)
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[Publications] D.P.Morgavi: "Presence in rumen bacterial and protozoal populations of enzymes capable of degrading fungal cell walls" Microbiology. 140. 631-636 (1994)
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[Publications] Onodera,R.: "Methionine and lysine metabolism in the rumen and the possible affects of their metabolites on the nutrition and physiology of ruminants" Amino Acids. 5. 217-232 (1993)
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[Publications] D.P.Morgavi: "In vitro metabolism of chitin and protein from ruminal fungi by ruminal protozoa." Animal Science and Technology(Japan). 64. 584-592 (1993)
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[Publications] T.Nagasawa: "Chiral high-performance liquid chromatogaphic separation of the three stereoisomers of 2,6-diaminopimelic acid without derivatisation." Journal of Chromatography. 653. 336-340 (1993)
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[Publications] 小野寺良次: "ルーメンプロトゾアのcDNAライブラリーの作製" ルーメン研究会報. 4. 11-18 (1993)
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[Publications] 小野寺良次: "家畜栄養学" 川島書店, 340 (1993)
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[Publications] 小野寺良次: "牛はどうやって草からミルクをつくるのか-ルーメンの秘密-" 新日本出版社, 164 (1990)
