1993 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトSRP 7S RNAと枯草菌scRNAの機能相関に基ずく枯草菌蛋白質分泌系の改良
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05454130
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
山根 國男 筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 幸治 筑波大学, 生物科学系, 講師 (40212097)
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| Keywords | 枯草菌 / 蛋白質分泌 / SRP(シグナルペプチド認識粒子) / 枯草菌Ffh / scRNA / リボヌクレオプロテイン |
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| Research Abstract |
枯草菌はα-アミラーゼやプロテアーゼなどの有用酵素を大量に分泌生産する能力を持っている。この高いタンパク質分泌能を利用してインターフェロンやワクチンなど高等生物に由来する有用タンパク質を分泌生産させる数多くの研究がなされてきた。宿主としての枯草菌もプロテアーゼ欠損株の作成や培養条件の検討など詳しい検討が行われた。しかしタンパク質の分泌生産量は低く、倍地中に多量蓄積させることには成功していない。そこで枯草菌のタンパク質分泌系そのものを分子生物学的に解析し、改変しようとしている。
ヒトすい臓細胞などにおけるタンパク質分泌ではER膜を通過する際に主役としてシグナルペプチド認識粒子(SRP)が機能している。SRPは300塩基のRNA(SRP 7S RNA)と6種類のタンパク質から構成されている。一方枯草菌には多量しかも安定なRNAとしてsmall cytoplasmic RNA(scRNA,271塩基)が存在する。これらの2種類のRNAは塩基配列上約50%の相同性を示し、また立体構造上も類似している。特にドメインIVは相同性が高い。そこでヒトSRPドメインIVに結合するタンパク質、SRP54、に類似している枯草菌Ffhを解析した。枯草菌ffh遺伝子を染色体DNAよりクローン化し、塩基配列を決定して、アミノ酸配列を推定した。相同性は32.6%であった。次に大腸菌で高発現させ、純化し、抗体を調製した。枯草菌細胞内ではFfhとscRNAがcomplexを形成していることを明らかにした。また枯草菌SRP様粒子は細胞質と細胞膜の両方に約1:1の割合で分布していた。細胞膜よりSRP様粒子を抽出し、カラムクロマトグラフィー、庶糖密度勾配超遠心法によって純化した。scRNA-分子に4種類の蛋白質が結合し、8Sのcomplexを形成していることを明らかにした。
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[Publications] K.Honda: "Cloning and Characterization of a Bacillus subtilis Gene Encoding a Homolog of the 54-Kilodalton Subunit of Mammalian Signal Recognition Particle and Escherichia coli Fth" J.Bacteriol.175. 4885-4894 (1993)
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[Publications] K.Honda: "Extracellular production of human hepatitis B virus preS2 antigen as hybrid proteins with Bacillus subtilis α-amylases in high-solt-concentration media." Applied Microbiology and Biotechnol.40. 341-347 (1993)
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[Publications] K.Kurahashi: "Cloning and nucleotide sequence of the Bacillus subtilis K trpB gene encoding tryptophan synthase β-subunit." Biosci.Biotech.Biochem.57. 1006-1009 (1993)
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[Publications] M.Nishiguchi: "Structural requirements of Bacillus subtilis small cytoplamic RNA for cell growth,sporulation and extracellular enzyme production." J.Bacteriol.176. 157-165 (1994)
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[Publications] A.Nakamura: "The transglycosilation reaction of cyclodextrin glucanotransferase is operated by a ping-pong mechanism." FEBS Lett.337. 66-70 (1994)
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[Publications] K.Nakamura: "The Bacillus subtilis SRP54 homologue,Ffh,has an intrinsic GTPase activity and forms a ribonucleoprotein complex with small cytoplasmic RNA in vivo." Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press).
