1993 Fiscal Year Annual Research Report

新生児型マルチプルカルボキシラーゼ欠損症の病因遺伝子と変異遺伝子発現蛋白の解析

Research Project

Project/Area Number	05454282
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	成澤邦明東北大学, 医学部, 教授 (90004647)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	呉繁夫東北大学, 医学部, 助手 (10205221) 鈴木洋一東北大学, 医学部, 助手 (80216457) 松原洋一東北大学, 医学部, 助教授 (00209602)
Keywords	ホロカルボキシラーゼ合成酵素 / ビオチン / cDNA / クローニング / ノーザンブロット
Research Abstract	新生児型マルチプルカルボクシラーゼ欠損症は生後間もなくから著明な代謝性アシドーシスを呈する有機酸代謝異常症である。本症の一次性障害はホロカルボキシラーゼ合成酵素(HCS)にある。我々は本症の病態を分子レベルで明きらかにすることを目的として、HCSの精製を行い、ヒトHCScDNAのクローニングを行ってきた。 1.ヒトHCScDNAのクローニング;精製酵素を複数のプロテアーゼで消化し、生じたペプチドをHPLCで分離後アミノ酸配列を決定した。ペプチドの情報に従ってプライマーを合成し、ヒト肝cDNAライブラリー由来のDNAを鋳型としPCRを行った。得られた約500bpのPCR産物をプローブとして、ヒト肝のoligo dT primed cDNAのλ gt10ライブラリーをスクリーニングした。ヒトHCScDNAは726個のアミノ酸をコードし、その分子量は80759に相当した。このアミノ酸配列はビオチンオペロンレプレッサーとHCS活性を併せ持つ大腸菌のbirA遺伝子産物のHCS活性領域とホモロジーが見いだされた。 2.ノーザンブロット;クローンテック社のヒトマルチプルノーザンブロット膜を用い、HCScDNAのPstI消化で生じた514bpのDNA断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。HCSmRNAはヒトの心筋、脳、肺、肝、骨格筋、腎、膵、胎盤のいずれにも発現が認められた。その大きさは約6kbと推定された。 3.部分HCS蛋白の大量発現;HCScDNAの一部をpET3aベクターに組み込み、これを大腸菌BL21に導入し、蛋白を発現させた。発現した部分HCS蛋白を兎に免疫し、抗ヒトHCS抗血清を得た。この抗ヒトHCS抗血清はヒト線維芽細胞HCS活性を著明に吸収した。このことは得られたcDNAが確実にヒトHCSのcDNAであることを強く示唆するものである。

Research Products

(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Aoki,M.et.al: "Mild ALS in Japan associated with novel SOD mutation" Nature Genetics. 5. 323-324 (1993)
[Publications] Ohura,T.et.al: "The molecular defect in propionic acidemia:exon skipping caused by an 8-bp deletion from an intron in the PCCB allele." Human Genetics. 92. 397-402 (1993)
[Publications] Ohura,T.et.al: "Propionic acidemia:sequence analysis of mutant mRNAs from Japanese B subunit deficient patients." J.Inher.Metab.Dis.16. 863-867 (1993)
[Publications] Suzuki,Y.et.al.: "Molecular cloning and chromosomal localization of human holocaboxyluse synthetase:A responsible gene for biotin dependency" Nature Genetics. (Submitted). (1993)
[Publications] Ogasawara,M.et.al.: "Identification of Two novel mutations in the methylmalonyl-CoA mutase gene with decreased levels of mRNA in methylmalonic acidemia" Human Mol.Genet.(in press). (1994)
[Publications] Chiba,Y.et.al.: "Purification and properties of bovine Liver holocarboxylase" Archives of Biochemistry and Biophysics. (in press). (1994)

1993 Fiscal Year Annual Research Report

新生児型マルチプルカルボキシラーゼ欠損症の病因遺伝子と変異遺伝子発現蛋白の解析

Principal Investigator

成澤 邦明 東北大学, 医学部, 教授 (90004647)

Research Products

[Publications] Aoki,M.et.al: "Mild ALS in Japan associated with novel SOD mutation" Nature Genetics. 5. 323-324 (1993)

[Publications] Ohura,T.et.al: "The molecular defect in propionic acidemia:exon skipping caused by an 8-bp deletion from an intron in the PCCB allele." Human Genetics. 92. 397-402 (1993)

[Publications] Ohura,T.et.al: "Propionic acidemia:sequence analysis of mutant mRNAs from Japanese B subunit deficient patients." J.Inher.Metab.Dis.16. 863-867 (1993)

[Publications] Suzuki,Y.et.al.: "Molecular cloning and chromosomal localization of human holocaboxyluse synthetase:A responsible gene for biotin dependency" Nature Genetics. (Submitted). (1993)

[Publications] Ogasawara,M.et.al.: "Identification of Two novel mutations in the methylmalonyl-CoA mutase gene with decreased levels of mRNA in methylmalonic acidemia" Human Mol.Genet.(in press). (1994)

[Publications] Chiba,Y.et.al.: "Purification and properties of bovine Liver holocarboxylase" Archives of Biochemistry and Biophysics. (in press). (1994)

成澤邦明東北大学, 医学部, 教授 (90004647)