微生物のホスホリパーゼの一次構造における活性部位の分子生物学的解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05454571
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 池沢 宏郎 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (40080163)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 とも子 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (70214533) ; 田村 悦臣 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (50201629) ; 田口 良 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (20080210)
• Keywords: ホスホリパーゼ / スフィンゴミエリナーゼ / 酵素蛋白質一次構造 / 酵素活性部位

Research Abstract

1.Penicillium notatumのホスホリパーゼBの発現ベクターの作成。
E.coliHB101に保持されているプラスミドpPLB18中のホスホリパーゼB遺伝子を鋳型として、PCR法によりpLB18中の53bpの不要なインサートを除去し、Bacillus brevi47用発現ベクターpNU211へのクローニングのための制限酵素サイトを導入した。次にこのPCR断片をpNU211へ導入し、そのトランスフォーマントを得た。これを用いて発現を試みたが、72時間の培養においてもホスホリパーゼBに対応する遺伝子由来の蛋白の発現は認められなかった。同様の方法で真核細胞発現ベクターpSVLにホスホリパーゼB遺伝子を導入したベクターpSVBを構築した。これを用いてCOS-1細胞内での発現を試みたが、ホスホリパーゼB活性は検出感度以下であった。上記2つの発現系においては、ホスホリパーゼBに細胞膜溶解作用があるため困難であると考えられるので、現在in vitro系での発現を検討している。
2.Bacillus cereusのスフィンゴミエリナーゼの一次構造における活性部位の分子生物学的解析。
各種蛋白修飾試薬による化学修飾の実験から、酸性アミノ酸(アスパラギン酸,グルタミン酸)を修飾するWoodward'sK試薬がスフィンゴミエリナーゼ活性を阻害することが示され、酵素活性にこれらアミノ酸が関与していることが示唆された。そこで他の細菌スフィンゴミエリナーゼと相同なアスパラギン酸のうち4つの部位を選び、グリシンに変えた変異体をつくり、B.brevis47のトランスフォーマントを得、酵素化学的性質を検討中である。

Research Products

• [Publications] Masahiro Tomita: "The role of acidic amino-acid residues in catalytic and adsorptive sites of Bacillus cereus sphingomyelinase" Biochimica et Biophysica Acta. 1203. 85-92 (1993)
• [Publications] 為石香織: "Bacillus cereus由来sphingomyelinaseのアスパラギン酸変異体の解析" 生化学. 65. 1031-1031 (1993)
• [Publications] 田村悦臣: "Bacillus cereus由来スフィンゴミエリナーゼのアスパラギン酸変異体の構築とその性質" 日本細菌学雑誌. 49. 237-237 (1994)
• [Publications] 田村悦臣: "脂質生化学研究35巻" 日本脂質生化学研究会, 4 (1993)