1994 Fiscal Year Annual Research Report
微生物のホスホリパーゼの一次構造における活性部位の分子生物学的解析
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05454571
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
池沢 宏郎 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (40080163)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 とも子 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (70214533)
田村 悦臣 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (50201629)
田口 良 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (20080210)
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| Keywords | ホスホリパーゼB / スフィンゴミエリナーゼ / PI特異的ホスホリパーゼC / Penicillium notatum / Bacillus cereus / Bacillus thuringiensis / 酵素蛋白質一次構造 / 酵素活性部位 |
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| Research Abstract |
1.Penicillium notatumのホスホリパーゼBの発現。
大腸菌用発現ベクターpKK232-2を用い、ホスホリパーゼBの遺伝子を組みこんだ発現ベクターpKKPBを構築し、大腸菌E.coliJM109内で糖鎖を含まない65KDaの不活性型で発現させることができた。また、研究の過程で本酵素がGPIアンカー型膜蛋白質で、P.notatumのスフェロプラストから自己消化的に膜より遊離されることが判明した(FEBS Letters 投稿予定)。さらに真核細胞での発現を試みている。
2.Bacillus cereusのスフィンゴミエリナーゼの一次構造における活性部位の解析-部位特異的に作成した変異型酵素の発現。
他の細菌スフィンゴミエリナーゼと相同な部位の4つのアスパラギン酸残基を1つずつ変えた変異体をつくり、B.brevis 47の大量生産系で発現させて調べた結果、C末端に近く、Hisの隣にあるアスパラギン酸残基が活性に必須であることがわかった。また、他の変異体では基質特異性の変化が認められた(Biochem.J.掲載予定)。
3.Bacillus thuringiensisのPI特異的ホスホリパーゼCの大量発現系の構築と変異型酵素の発現。本酵素の遺伝子を発現ベクターpNU211に組みこんだベクターpNUPI1-1をB.brevis 47で大量発現させることに成功した(FEMS Letters 投稿予定)。この系で変異型酵素を発現させる計画である。
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[Publications] Hiro-omi Tamura: "Mutation in aspartic acids modifies catalytic and hemolytic activities of Bacillus cereus sphingomyelinase" Biochemical Journal. (in press). (1995)
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[Publications] 山田敦子: "B.cereus由来sphingomyelinaseの部位特異的変異体の構築とその解析" 生化学. 66. 818-818 (1994)
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[Publications] 田村悦臣: "Bacillus cereus由来スフィンゴミエリナーゼのアスパラギン酸変異体の構築とその性質" 日本細菌学雑誌. 49. 237-237 (1994)
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[Publications] 小林とも子: "B.brevisを用いたB.thuringiensis由来PIPLC大量発現系の構築" 生化学. 66. 1018-1018 (1994)
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[Publications] 小林とも子: "脂質生化学研究36巻" 日本脂質生化学研究会, 4 (1994)
