塩基非特異的リボヌクレアーゼの触媒機構・塩基認識機構の解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05454574
• Research Institution: Hoshi College of Pharmacy
• Principal Investigator: 入江 昌親 星薬科大学, 薬学部, 教授 (70061265)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 和郎 昭和大学, 薬学部, 教授 (00012675) ; 岩間 正典 星薬科大学, 薬学部, 講師 (50130753) ; 扇 和子 星薬科大学, 薬学部, 助教授 (90061291)
• Keywords: リボヌクレアーゼ / 反応機構 / 塩基認識機構 / 遺伝子工学 / X線結晶解析

Research Abstract

1.RNase T2 familyに属する酵素中ニワトリ肝、牛脾臓、カエル、イカ肝のRNaseの構造研究を行い、ニワトリ肝、イカRNaseの構造を明らかにした。ニワトリ肝の酵素は塩基認識部位、B1およびB2部位の一部の真菌酵素と異なった配列あるいは欠損がみられている。またこれら動物由来の酵素のN-末端の構造は真菌よりむしろ植物の酵素に類似していた。 2.動物由来の酵素で欠損のみられるTyr57の場所に側鎖の短いAlaを置換した、Tyr57Alaについて結晶化が成功し、現在詳細なX線結晶解析を行っている。 3.第一の塩基認識部位B1サイトのTyr57, Trp49の改変体の作成とその酵素学的研究の結果、Trp49は活性中心の保持に極めて重要な残基であること、Tyr57はかならずしも芳香環である必要が無いが芳香環側鎖の場合の法が高い活性を示すことを見いだした。また塩基認識部位の一つAsp51をAsn, Glu,Gln Ser, Thr Ala, Lysに置換した酵素について特異性を解析したところ、いずれもpoly I, poly Cに対する分解能が上がり、poly Aに対する活性が減少した。特にAsp51Ser, Asp51Thr, Asp51AsnではXpGに対する活性はG>C>AとなりRNase Rhのアデニン塩基優先性がグアニン塩基優先性に変化していた。この事はAsp51がアデニン塩基優先性となる重要な条件であることを示しいる。触媒中心に関係するLys108の改変体の解析の結果、Arg, Thr, Serへの置換は酵素活性がかなり残存することからLysの代わり得ることを知った。 4.トマトRNase Leの酵母での発現に成功し、現在その結晶を所得したので今後解析が進むにつれて真菌酵素との三次元構造の相違を示すことが出来るであろう。

Research Products

• [Publications] Ohgi, K., Takeuchi, K., Iwama, M. & Irie, M.: "Enzymatic properties of mutant enzymes at Trp49 and Tyr57 of RNase Rh from Rhizopus niveus." J. Biochem.119. 9-15 (1996)
• [Publications] Ohgi, K., Takeuchi, K., Iwama, M. & Irie, M.: "Enzymatic properties of mutant forms of RNase Rh from Rhizopus niveus as to Asp51." J. Biochem.119. No.3 (1996)