カセット・キメラ法による視物質の機能解析

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05454633
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 徳永 史生 大阪大学, 理学部, 教授 (80025452)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久冨 修 大阪大学, 理学部, 助手 (60231544)
• Keywords: 視物質 / カセット・キメラ法 / キメラ / 視覚 / アミノ酸配列 / 蛋白質工学 / DNA組換え / 培養細胞での発現

Research Abstract

本研究では、視物質のアミノ酸配列と機能との関連を知るために、数種の視物質のcDNAをクローン化し、それらを用いて、ウシ・ロドプシンを元にしたカセット法でキメラ視物質を作成し、その機能を解析をしている。
1.キンギョは5種類の吸収極大波長の異なる視物質を持つ。既にロドプシン及び赤、緑、青の色覚色素のcDNAがクローン化され、アミノ酸配列が報告されている。我々は、キンギョ網膜のcDNAを検索し、残るUV感受性視物質のcDNAの翻訳領域全長を得た。推定されるアミノ酸配列は、これまでに明らかにされている視物質のうち、ヒトの青やニワトリの紫感受性視物質と最も高い相同性を示し、UV感受性視物質と推定された。
2.ウシ・ロドプシンcDNAの、吸収波長の決定に重要な役割を果たすと考えられている領域の前後に、アミノ酸を変異させないように、制限酵素認識配列を設けた。この制限酵素認識部位を用いて、ウシ・ロドプシンと他の視物質遺伝子とのキメラ遺伝子を作成し、組織培養細胞中でキメラ視物質を発現させた。既知の視物質のアミノ酸配列を、購入したパソコンで解析し、キメラ視物質を設計した。産生されたキメラ視物質は、購入した冷却微量遠心機を用いて精製し、吸収スペクトルは購入した低温バスサーキュレターを装着した既設の分光光度計で測定した。現在のところウシロドプシンと吸収スペクトルの大きく異なるキメラ視物質は得られていない。
3.パルミチンが付加される2つのシステインの1つ、または2つともをセリンに変えた変異ロドプシンを発現させたが、吸収スペクトルや光反応中間体には変化が見られなかった。また糖鎖が付加される2番目のアスパラギンをグルタミンに変えた変異ロドプシンは吸収スペクトルの変化は無かったが、培養細胞における発現量が少なかった。糖鎖は細胞膜へのロドプシンの輸送に関係していることが裏付けられた。

Research Products

• [Publications] Satoru Kawamura: "Recoverin has S-modulin activity in frog rods." Journal of Biological Chemistry. 268. 14579-14582 (1993)
• [Publications] Mikio Kataoka: "Recoverin alters its surface properties depending on both calcium-binding and N-terminal myristoylation" Journal of Biochemistry. 114. 111-116 (1993)
• [Publications] Koichi Ozaki: "Maturation of major Drosophila rhodopsin,nina E,requires chromophore 3-hydroxyretinal." Neuron. 10. 1113-1119 (1993)
• [Publications] 徳永 史生: "感覚受容システム" 蛋白質核酸酵素. 38. 1180-1186 (1993)
• [Publications] 徳永 史生: "視覚器-視興奮の分子機構と網膜再生" 生体の科学. 45. 62-70 (1994)