1993 Fiscal Year Annual Research Report
受容体応答を指標とした遺伝子転写活性のリアルタイム計測法の研究
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05557003
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高橋 國太郎 東京大学, 医学部(医), 教授 (10010034)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡村 康司 東京大学, 医学部(医), 助手 (80201987)
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| Keywords | 転写活性 / レポータ遺伝子 / イオンチャネル / 非侵襲的 / ホヤ胚 / 単離胚細胞 / ホヤNaチャネル / グルタミン酸受容体 |
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| Research Abstract |
従来、遺伝子の転写調節機構は、その5'端上流にある転写制御領域の下流にβ-GAL,CAT,Luciferase等酵素の遺伝子をレポータとして繋いだDNAを外来性に導入し、発現した酵素活性や抗原性を検出して解析されてきた。しかし、これらの方法では、転写活性を検出した細胞について生理的機能を解析することができない。イオンチャネルは、生細胞で実時間で電気的に定量しうる膜蛋白であり、特に受容体チャネルはアゴニスト依存性に開き、細胞内イオン濃度変化を蛍光指示薬等により非侵襲的に測定できる。当研究ではホヤ胚割球をモデル系として、チャネルの翻訳領域を各種遺伝子の転写制御領域に連結して発現させ、細胞の応答を電気的・光学的手法により検出し、非侵襲的に転写活性を定量するシステムを開発する。平成5年度の成果(1)外来性に発現させるイオンチャネル遺伝子として、先ずホヤ幼生Naチャネル自身を用いるために、その全塩基配列を決定した。このNaチャネルはTTX非感受性であり、ラット脳Naチャネル等と比較してss2部の陰電荷のアミノ酸の点変異によることが示唆された。ホヤ神経割球では内因性Naチャネルと区別するため、アミノ酸配列を変換してTTX感受性にすることを計画している。(2)得られた内因性神経特異的Naチャネル遺伝子をホヤアクチン遺伝子の転写調節領域の下流に連結した。これを本来Na電流のないホヤ予定筋割球へ微小注入し、Na電流が出現するか否かを調べている。筋細胞にNa電流を発現するためのFactorが存在しない可能性も考えられるので、(3)RSVヴィルスのプロモータの下流に連結したものも対照として作製した。(4)受容体チャネルをレポータ遺伝子として適用するため、ホモオリゴマーで機能し、且つCa透過性をもつラットグルタミン酸受容体GluR1遺伝子をアクチン遺伝子の転写調節領域あるいはRSVプロモータに連結したレポータ遺伝子を作製中である。
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[Publications] Okamura,Y.: "Neural induction suppresses early expression of the inward-rectifier K^+ channel in the ascidian blastomere." J.Physiol.(London). 463. 245-268 (1993)
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[Publications] Okado,H.: "Neural differentiation in cleavage-arrested ascidian blastomeres induced by a proteolytic enzyme." J.Physiol.(London). 463. 269-290 (1993)
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[Publications] Okamura,Y.: "Primary structure and neuronal gene expression of an ascidian sodium channel." Jap.J.Physiol.43 Spl.2. S165 (1993)
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[Publications] Okamura,Y.: "The ascidian embryo as a prototype of vertebrate neurogenesis." BioEssays. 15. 1-8. (1993)
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[Publications] Ono,F.: "Neuron-specific gene expression of Na^+ channel in a single neurally-induced blastomere from an ascidian embryo." Neurosci.Res.suppl.18. S126 (1993)
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[Publications] Takahashi,K.: "Neuronal excitability is induced by cell-cell interactions during early embryogenesis." Perspect.Dev.Neurobiol.(in press.).
