尿、便等の臨床検体によるPCRを用いた早期診断システムの開発

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05557059
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 渡邉 俊樹 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (30182934)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森 茂郎 東京大学, 医科学研究所, 教授 (30010424) ; 武藤 徹一郎 東京大学, 医学部(病), 教授 (20110695)
• Keywords: 臨床検体 / 癌 / 早期診断 / 突然変異 / 癌遺伝子 / PCR

Research Abstract

本年度の研究計画のうち以下の項目につき検討を加えた。
DNA抽出法に関しては、glass beadsによる吸着を原理とするS&S社のキットを用いることにより、他の精製法に比較して、簡便かつ安定してPCRによる解析可能なDNAを得ることが出来ることが明らかになった。他の方法では、PCR反応に対するインヒビターの混入によると思われる結果のばらつきがコントロールできなかった。抽出法に関する検討を優先したため、分析対象となる検体に関しては、尿・便についてのみ解析したが、便のみでなく尿に関しても、沈さを用いることにより同様にPCRで解析可能であった。変異遺伝子の検出法に関する検討では、マイクロタイタープレート上に固定したプローブを用いて、断片化したPCR産物をハイブリダイズし、Klenow酵素によりdigoxygenin化ヌクレオチドを取り込ませる方法の基礎検討を行い、取り込まれたdigoxygenin化ヌクレオチドを抗digoxygenin抗体を用いてプレート上で発色させることによって検出する系が基本的に利用可能であることを明らかにした。PCRのコンタミネーションを予防する方法として、PCR産物の持ち込みによるものは、基質としてdTTPの代わりにdUTPを使用し、Uracyl N-glycosiyaseで反応前の検体を処理することで、ほぼ完全に予防できることが確認された。SSCPに代わる変異の検出法については、1baseのmismatchを特異的に検出し切断する方法の基礎検討を行っているところである。
これらの検討結果は、既存の技術の追試、あるいは応用のための基礎検討と言う性質上、これまでは学会あるいは論文による発表は行っていない。