DNAプローブ生物化学発光システムを応用した歯周病病原細菌の検出と応用

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05557086
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 安孫子 宜光 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (70050086)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 押原 渉 東レ株式会社医療システム研究所, 研究員 ; 木山 道子 日本大学, 松戸歯学部, 副手 (50256905) ; 早川 光央 日本大学, 松戸歯学部, 専任講師 (10112955)
• Keywords: 歯周病 / DNAプローブ / リボプローブ / P.gingivalis / A.actinomycetemcomitans / 細菌検査

Research Abstract

成人性歯周炎の最重要な関連菌である P.gingivalis からすでに遺伝子クローニングが成功している40-kDa外膜遺伝子のC-末端側の特異塩基配列部分であるDraI-HincII 270-bをRNAプローブ作製用ベクターpGEM5Zにサブクローニングを行い、T7 RNAポリメラーゼを用いin vitro transcription systemによりdigoxigenin 標識リボプローブを合成した。臨床分離株を含む P.gingivalis株およびその他の歯周病関連菌20種の染色体DNAをdot-blotし変性後、作製したリボプローブと反応させた後、東レから提供されたRNA/DNA複合体に対する抗体を反応させ、さらにalkaline phosphatase標識した二次抗体を反応させて発色基質を用いて検出を行った。その結果、P.gingivalis株のみが発色し、その他の歯周病関連菌はしなかった。しかし、検出感度は低く感度を上げるために、P.gingivalis の glycylprolyl aminopeptidase 遺伝子クローンの2.9-kb DNAについて同様の実験を行った。その結果、P.gingivalisの特異的検出が可能でかつ、0.01mugの高感度の検出が可能となった。
我々は、すでにA.actinomycetemcomitansの抗原タンパク質遺伝子のクローニングに成功しているが、最近、leukotoxin遺伝子が本菌の特異的検出に有用であることが発表された。そこでleukotoxin遺伝子を複製するためのDNA primerの化学合成を行い、PCR法により、A.actinomycetemcomitans染色体DNAを用いてleukotoxin遺伝子の複製を行った。今後PCR産物をpGEM5Zにサブクローニングを行いリボプローブsystemによる高感度検出を計画している。