DNAプローブ生物化学発光システムを応用した歯周病病原細菌の検出と応用

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05557086
• Research Institution: NIHON UNIVERSITY
• Principal Investigator: 安孫子 宜光 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (70050086)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 押原 渉 東レ株式会社, 医療システム研究所, 研究員 ; 木山 道子 日本大学, 松戸歯学部, 副手 (50256905) ; 早川 光央 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (10112955)
• Keywords: 歯周病 / 細菌検査 / P.gingivalis / A.actinomycetemcomitans / A.viscosus / DNAプローブ / リボプローブ / 遺伝子診断

Research Abstract

従来の歯周病診断項目は、臨床パラメーターに基づいた歯周組織の破壊程度を観察するもので疾病活動度を捉えられることは困難であるといわれている。疾病活動度を診断できるような細菌検査の実用化を目的に、疾病活動期に関与するP.gingivalisおよびA.actinomycetemcomitans、静止期の細菌叢の代表としてA.viscosusをそれぞDNA診断の標的として選択した。これら各細菌の特異クローン遺伝子をクローニングし、RNA合成可能なプラスミドにサブクローニングして非放射性標識リボプローブの作製を試みた。開発したリボプローブは、いずれも特異性が高く、これら特異細菌の検出プローブとして有用であることが判明した。つぎに多サンプルを簡便かつ安価に検査できるように、測定感度10^<-21>mole/30分というアリカリホスファターゼ/ルミジェンPPDを用いる化学発光系を利用した東レ基礎研究所で開発された臨床用生物化学発光検出システムキットを応用して、抗RNA-DNA抗体を用いた歯周病病原細菌の検出法を化学発光法で試みた。その結果、10^4分子までは発光度とリニアーであったが10^5分子以上になると測定値が減少し、検量リニアリティーに問題が残った。その原因として、DNA試料作成時に混在するRNAやDNA-DNA hybridが非特異的に抗RNA-DNA hybridと反応してしまうことが考えられた。そこで、PCR法で極少量の臨床サンプルから特異DNAを増幅してから、同じ方法で検出を試みたところ比較的リニアリティーのある検出ができた。しかしながら、一般医院のチェア-サイドでの実用化を考慮すると、PCR法には特殊な機器と技術を要し、汎用化する大きな障害となる。今後、この問題の解決に向けて、非特異的に混在する分子の除去や、生物化学発光検出システムの新たな開発を推進する必要がある。

Research Products

• [Publications] 安孫子宜光: "歯周病の遺伝子診断は可能か" 歯界展望. 82. 41-54 (1993)
• [Publications] 對島 誠: "Porphyromonas gingivalis外膜タンパク質遺伝子特異領域のDNAのクローニングと非放射性DNAプローブの開発" 日大口腔科学. 20. 29-39 (1994)
• [Publications] 玉舎秀規: "Porphyromonas gingivalis外膜タンパク質遺伝子合成オリゴヌクレオチドDNAプローブ" 日大口腔科学. 20. 406-413 (1994)
• [Publications] 野地澄晴: "歯科領域の遺伝子(DNA)診断に向かって" 日本歯科医師会雑誌. 47. 17-27 (1994)
• [Publications] 安孫子宜光: "見えてきた遺伝子診断の全貌 歯周病の細菌検査へのDNA診断の応用" 歯界展望. 84. 840-851 (1994)
• [Publications] 小板橋誠: "Porphyromonas gingivalis Glycylprolyl Aminopeptidase遺伝子リボプローブの開発" 日大口腔科学. 20. 499-507 (1994)
• [Publications] 新谷雅隆: "Actinobacillus actinomycetemcomitansのロイコトキシン遺伝子非放射性リボプローブの開発" 日大口腔科学. 22. 27-35 (1996)
• [Publications] 清水克貴: "Porphyromonas gingivalis glycylprolyl diaminopeptidase高産生性遺伝子クローンの作成" 日大口腔科学. 22. 36-44 (1996)
• [Publications] Hiratsuka K.: "Characterization of recombinant 150-kDa S-layer protein from Campyrobacter rectus" 日大口腔科学. 22. (1996)
• [Publications] Kanasugi N.: "Detection of Porphyromonas gingivalis by DNA-RNA hybridization with non-radioactivity labeled riboprobe" 日大口腔科学. 22. (1996)
• [Publications] 安孫子宜光: "非放射性リボプローブを利用した歯周病関連菌の検出" 歯界展望. (1996)