病原ビブリオの迅速同定法の開発

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05557106
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 篠田 純男 岡山大学, 薬学部, 教授 (50029782)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三好 伸一 岡山大学, 薬学部, 助手 (60182060) ; 山本 重雄 岡山大学, 薬学部, 助教授 (40033229)
• Keywords: 病原ビブリオ / 血清学的同定法 / polymerase chain reaction / 迅速同定法 / Vibrio vulnificus

Research Abstract

本研究課題で対象としている病原ビブリオは河川、海水を棲息域とする細菌であり、その迅速同定法の開発の意義は食品衛生監視のための水産物からの検出と早期治療のための患者材料からの検出にある。本年度は日和見感染的に重篤な敗血症を起こすVibrio vulnificusの溶血毒素をターゲットにした検査法の開発を中心に行った。まず本毒素の精製法を改良して毒素を大量に得る方法を確立し、これを用いて抗血清を得た。ついで、本菌の分離株を収集し、本毒素に対する抗体による免疫学的調査および本毒素遺伝子を用いたSouthern bolt法による解析により、本毒素が本菌に普遍的に存在することを確認した。すなわち本毒素そのもの、あるいはその遺伝子の検索を行えば、本菌の同定が可能である。本菌により感染が起こった場合には、できるだけ早期に抗生物質による治療を行えば救命が可能であるが、時期を失すると致命的な敗血症に発展する。そのため、他の疾患以上に迅速な菌の検出、同定が必要である。このような目的にpolymerase chain reaction(PCR)が有用であるが、そのうちで酵素免疫測定法と組み合わせたenzyme detection PCR(ED-PCR)を採用した。この方法ではプライマーの一方をハプテン、他方をビオチンで標識し、PCRを行ったのちにビオチンを介してストレプトアビジンプレートに固定し、ハプテンに対する抗体による酵素免疫測定を行うことにより、電気泳動等を行うことなく速やかに検出が可能である。毒素遺伝子の塩基配列から250bpをはさんだ2つの領域を選択してオリゴヌクレオチドを合成し、菌の浮遊液を用いてED-PCRを行うと10^2PFUの菌の存在で検出が可能であったが、血液材料に応用した場合には血液成分による妨害がみられた。しかし、溶血処理後、遠沈洗浄を行った場合には同様な感度で測定が可能であり、実用化への道が開けたといえる。

Research Products

• [Publications] E.G.Oh,Y.Tamanoi,A.Toyoda,K.Usui,S.Shinoda: "Simple purification method for a Vibrio vulnificus hemolysin by a hydrophobic column chromatoqraphy in the presence" Microbiology and Immunology. 37. 975-978 (1993)
• [Publications] E.G.Oh,H.Yamanaka,S.Miyoshi,S.Shinoda: "Homogeneity of hemolysin produced by Vibrio vulnificus isolates" Journal of Natural Toxins. 3 (in press). (1994)