アミノ酸異性化酵素由来合成DNAを用いる食品生菌数の迅速測定法に関する研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05558002
• Research Institution: Nara Women's University
• Principal Investigator: 横井川 久己男 奈良女子大学, 生活環境学部, 講師 (60230637)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 金次 奈良女子大学, 生活環境学部, 教授 (20031643) ; 河合 弘康 奈良女子大学, 生活環境学部, 教授 (80026525)
• Keywords: ハイブリダイゼーション / アラニンラセマーゼ / DNAプローブ / 生菌数測定

Research Abstract

種々の細菌間で高い相同性を示すアラニンラセマーゼの活性中心領域に対応する種々のDNAを合成し(17-23塩基対)、5'末端をビオチンで標識した。これらのDNAプローブを用いて、ドットブロット法によりハイブリダイゼーションの条件検討、および、ビオチン検出システムとしてのストレプトアビジン-アルカリホスファターゼの反応条件を調べた。ハイブリダイゼーションに影響を与える最も重要な条件、温度、プローブ濃度、反応時間では、25℃、10pmol/ml、16時間が最もハイブリダイゼーションに適していた。合成DNAプローブとしては、イノシン含有DNAよりミックスプローブの方が特異性の点で優れていた。代表的細菌の染色体DNAをもちいたDNAハイブリダイゼーションでは、Bacillus subtilis,Pseudomonas fluorescens,Escherichia coli由来DNAのいずれもが合成DNAプローブと反応し、細菌種にかかわらず1種類のアラニンラセマーゼ遺伝子断片を用いて、異なる細菌DNAを同様に検出できる可能性が高まった。また、食品の全処理条件では、フェノール抽出、RNase処理が好ましいと考えられたが、より簡便なアルカリSDS法や煮沸法のみで調製した試料を用いて検討が必要と考えられる。

Research Products

• [Publications] 林英姫: "A new amino acid racemase with threonine α-epimerase activity from Pseudomonas putida:purification and characterization." J.Bacteriology. 175. 4213-4217 (1993)
• [Publications] 横井川久己男: "Thermolabile alanine racemase from a psychrotroph,Pseudomonas fluorescens:purification and properties," Biosci.Biotech.Bioeng.57. 93-97 (1993)