1993 Fiscal Year Annual Research Report
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05558085
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
遠藤 斗志也 名古屋大学, 理学部, 教授 (70152014)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中井 正人 名古屋大学, 理学部, 助手 (90222158)
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| Keywords | 無細胞タンパク質合成系 / RNAポリメラーゼ / 大腸菌 / 酵母 |
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| Research Abstract |
無細胞タンパク質合成系の高効率化をめざして、タンパク質合成量の改良を試みた。大腸菌からS30エクスクトを調製し、内在性のRNAポリメラーゼによる転写・翻訳共役系についてまず検討した。転写反応の基質として系に加えるDNAの精製法を各種比較したところ、PEG沈殿による方法が最も適していることが分かった。次に外からT7またはSP6RNAポリメラーゼを加えることにより転写反応を行う方法を検討したところ、内在性のRNAポリメラーゼによる転写・翻訳共役系よりも、タンパク合成効率が高いことが明らかになった。次に系に加えるSP6RNAポリメラーゼの量を増やしていったところ、加えた量に比例してタンパク合成効率が増加した。しかしこの方法には、高価なSP6RNAポリメラーゼを用いるという経済上の問題があるため、大腸菌より組換えSP6RNAポリメラーゼを大量に調製することを検討中である。また、SP6RNAポリメラーゼを大量発現している大腸菌よりS30エクストラクトを調製し、タンパク合成を行う方法を検討しているが、今のところ、至適条件を見いだせていない。
一方、真核生物のタンパク質をactiveな形で得るための無細胞タンパク質合成系の高機能化をめざして、酵母よりサイトゾル画分を調製し、これを用いてタンパク質合成を行う方法を検討した。対数増殖期の酵母細胞を集菌し、ビードビーターで細胞を破砕、遠心によりサイトゾル画分を得た。これをゲル濾過して、低分子両物質を除去し、酵母ライセートとした。このライセートを用いて、種々の遺伝子について、タンパク質合成を試みている。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Nakai,M.et al: "Sec Y protein is localized in both the cytoplasmic and thylakoid membranes in the cyanobacterium Synechococcus PCC7942" Biochem.Biophys.Res.Commun.193. 228-234 (1993)
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[Publications] Nakai,M.et al: "Cloning of the YAP19 gene encoding a putative yeast homolog of AP19,the mammalian small chain of the clathrin-assembly proteins." Biochem.Biophys.Acta. 1174. 282-284 (1993)
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[Publications] Nakai,M.et al: "Intramitochondrial Protein Sorting:isolation and characterization of the yeast MSP1 gene which belongs to a novel family of putatire ATPases" J.Biol.Chem.268. 24262-24269 (1993)
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[Publications] Nakai,M.et al: "The BCl-2 Protein is in serted into the outer membrane but not into the inner membrane of rat liver mitochondria in vitro." Biochem.Biophys.Res.Commun.196. 233-239 (1993)
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[Publications] Nakai,M.et al: "Acidic regions of cytochrome C_1 are essential for ubiquinol-cytochrome C reductase activity in yeast cells lacking the acidic QCR6 protein" J.Biochem.114. 919-925 (1993)
