1993 Fiscal Year Annual Research Report

細胞内酵素活性のin situ,real time観測法の開発

Research Project

Project/Area Number	05558092
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	星元紀東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (20012411)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	伊藤良延ニコン株, 光機設計部, (研究員)マネージャ桜井勝清生化学工業株, 東京研究所, (研究員)次長千葉和義東京工業大学, 生命理工学部, 助手 (70222130)
Keywords	プロテアーゼ / 細胞内酵素活性 / マイクロインジェクション
Research Abstract	生命の基本単位である細胞は、様々な内在性酵素の活性と局在性を厳密に制御することによって、その複雑で精緻な生命活動を実現している。現在までの研究手法は基本的に破壊検査によるものであり、実時間(real time)での酵素活性測定とその分布の動的変化の観察はほとんど不可能であった。本研究では、「生きた細胞」を「非破壊的」に用いて、細胞内酵素の分布と活性の変化を観察し測定する手法(観測法)を開発する。本年度は、分解されると発蛍光となる酵素基質を開発し、これを細胞内に注入し、顕微測光することにより酵素活性を測定した。細胞膜不透過性の蛍光物質、7-アミノクマリン-4-メタンスルフォン酸のアミノ基に種々のペプチドを結合し、プロテアーゼ基質(Bz-Arg-CAMS,Z-Phe-Arg-CAMS,Z-Phe-Leu-CAMS)を合成した。これらをヒトデ卵内にマイクロインジェクションしたところ、それぞれの分解速度は、0.033、0.23、1.3(10^<-18>mole/min/oocyte)であった。またピラニン誘導体として、フォスファターゼ、フコシダーゼ基質を合成した。これらの合成基質を、ヒトデ卵にマイクロインジェクションして、一次元測光における基質の分解速度を定量中である。細胞内外の酵素活性を別々に測定する手法(vectorial assay)を確立するために、ホヤの精子を用いて上記のプロテアーゼ基質を投与したところ、精子活性化に伴って基質分解量が増加することを見出した。このことは精子活性化に伴って細胞外に活性型プロテアーゼが分泌されることを示唆しており、現在検討中である。疎水性の高いアミノ酸配列を持つプロテアーゼ基質は、水溶液になり難いことが明らかになった。これを避けるために、さらに親水性の蛍光物質の合成を検討している。

Research Products
(8 results)

All Other

All Publications (8 results)

[Publications] Motonori HOSHI: "A New Fluorogenic Substrate with Pyranine System for Phosphatases" Chem.Pharm.Bull.40. 786-788 (1992)
[Publications] Motonori HOSHI: "Participation of 650-kDa Protease(20S Proteasome)in Starfish Oocyte Maturation" Develop.Biol.150. 414-418 (1992)
[Publications] Motonori HOSHI: "Involvement of a Sperm Aminopeptidase in Fertilization of the Sea Urchin" Experientia. 47. 100-103 (1991)
[Publications] Motonori HOSHI: "Chymotrypsin-like enzymes are involved in sperm penetration through the vitelline coat of Ciona intestinalis." Molec.Reprod.Dev.26. 319-323 (1990)
[Publications] Kazuyoshi CHIBA: "The Primary Structure of the α-subunit of a Starfish G Protein Involved in 1-Methyladenine-Induced Oocyte Maturation" Eur.J.Biochem.207. 833-838 (1992)
[Publications] 桜井勝清: "Solid phase synthesis of peptides with polyethyleneglycol-modified protease in organic solvents." Biotechnology Letters. vol12. 685-688 (1990)
[Publications] 星元紀(分担): "「細胞社会のグリオバイオロジー」グリコバイオロジーシリーズ3" 講談社サイエンチフィク, 238 (1993)
[Publications] 星元紀(分担): "「今なぜ糖鎖か」第1巻「糖鎖と生命」" 東京化学同人(印刷中),

1993 Fiscal Year Annual Research Report

細胞内酵素活性のin situ,real time観測法の開発

Principal Investigator

星 元紀 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (20012411)

Research Products

[Publications] Motonori HOSHI: "A New Fluorogenic Substrate with Pyranine System for Phosphatases" Chem.Pharm.Bull.40. 786-788 (1992)

[Publications] Motonori HOSHI: "Participation of 650-kDa Protease(20S Proteasome)in Starfish Oocyte Maturation" Develop.Biol.150. 414-418 (1992)

[Publications] Motonori HOSHI: "Involvement of a Sperm Aminopeptidase in Fertilization of the Sea Urchin" Experientia. 47. 100-103 (1991)

[Publications] Motonori HOSHI: "Chymotrypsin-like enzymes are involved in sperm penetration through the vitelline coat of Ciona intestinalis." Molec.Reprod.Dev.26. 319-323 (1990)

[Publications] Kazuyoshi CHIBA: "The Primary Structure of the α-subunit of a Starfish G Protein Involved in 1-Methyladenine-Induced Oocyte Maturation" Eur.J.Biochem.207. 833-838 (1992)

[Publications] 桜井 勝清: "Solid phase synthesis of peptides with polyethyleneglycol-modified protease in organic solvents." Biotechnology Letters. vol12. 685-688 (1990)

[Publications] 星 元紀(分担): "「細胞社会のグリオバイオロジー」グリコバイオロジーシリーズ3" 講談社サイエンチフィク, 238 (1993)

[Publications] 星 元紀(分担): "「今なぜ糖鎖か」第1巻「糖鎖と生命」" 東京化学同人(印刷中),

星元紀東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (20012411)

[Publications] 桜井勝清: "Solid phase synthesis of peptides with polyethyleneglycol-modified protease in organic solvents." Biotechnology Letters. vol12. 685-688 (1990)

[Publications] 星元紀(分担): "「細胞社会のグリオバイオロジー」グリコバイオロジーシリーズ3" 講談社サイエンチフィク, 238 (1993)

[Publications] 星元紀(分担): "「今なぜ糖鎖か」第1巻「糖鎖と生命」" 東京化学同人(印刷中),