細胞内酵素活性のin situ,real time観測法の開発

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05558092
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 星 元紀 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (20012411)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 良延 ニコン(株), 光機事業部, マネージャー ; 山本 久夫 生化学工業(株), 東京研究所, 室長 ; 千葉 和義 東京工業大学, 生命理工学部, 助手 (70222130)
• Keywords: プロテアーゼ / 蛍光物質 / ヒトデ / 卵成熟 / 酵素活性

Research Abstract

本研究では、「生きた細胞」を「非破壊的」に用いて、細胞内酵素の分布と活性の変化を観察し測定する手法(観測法)を開発する。そのためのモデル系として、主にヒトデ卵母細胞内のプロテアーゼ活性を測定してきた。これまでの問題点として、酵素基質が一般に疎水性であり、水に溶け難いことがあげられる。
本研究で開発された細胞膜不透過性の蛍光物質(7-アミノクマリン-4-メタンスルフォン酸)にSuc-Phe-Leu-Argを結合したプロテアーゼ基質を合成したところ、高濃度(5mM)でも水溶液になった。これをヒトデ卵にマイクロインジェクションしたところ、蛍光量が経時的に増加した。プロテアソーム特異的な阻害剤であるMG115で卵を処理したところ、蛍光量に変化がなくなったことから、本基質によってプロテアソーム活性が測定できることが示された。
ヒトデ未成熟卵は、1-メチルアデニン(1-MA)で処理すると成熟する。卵成熟過程における、本基質の分解初速度を求めたところ、1-MA処理以降、上昇し始め、約一時間後に活性が最大になることが明らかになった。すなわち成熟卵と未成熟卵のVmaxは、それぞれ3.2と0.82(μM/min)だった。一方Kmについては、それぞれ96と22(μM)であった。よって本観測法によって、「生きた細胞」の酵素活性の変化が、リアルタイムで測定できることが示された(特許出願準備中)。
天然に存在する新規発光基質の探索を目的として、群体ホヤの一種であるクラベリ-ナの発光機構についても解析し、発光細胞を同定した。