1994 Fiscal Year Annual Research Report
コムギ族外来遺伝子導入育種のためのRAP-DNA分子マーカーの開発
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05660005
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
富田 因則 鳥取大学, 農学部, 助手 (70207611)
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| Keywords | PCR(Polymerase Chain Reaction) / 制限酵素EcoO109I / Secale cereale / プライマー / 染色体標識DNA / レトロボゾン / 塩基配列 / STS(sequence-tagged site) |
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| Research Abstract |
コイムギSecale cereale L.のゲノムには制限酵素EcoO109Iサイト5'-PuGGNCCPy-3'が多数散在する(Tomita et al.1993)ので、EcoO109Iサイトに3塩基を付加した配列をプライマーにしてPolymerase Chain Reaction(PCR)を行い、ライムギ染色体から特異的に増幅されて染色体標識となるDNA断片を獲得した。
ライムギ-コムギ間で増幅断片長多型を示すEcoO109Iプライマーでライムギ染色体添加コムギ系統シリーズを鋳型とするPCRを行い、1R〜7R染色体にそれぞれ特異的な10種類のDNA断片を検出した。これらをアガロースゲルから回収し、ナイロンメンブレンにトランスファーしたライムギ染色体添加コムギ系統のPCR産物とハイブリダゼーションさせた結果、いずれも回収したDNA断片以外にはハイブリッドせず、ライムギ染色体から特異的に増幅させる配列であった。さらに、10種類の染色体特異的DNA断片をpMOSBlueにライゲーションし、ディレーションクローンを作製して塩基配列を決定した。その結果、両端にはEcoO109Iプライマーの配列が確かに存在し、レトロポゾンに特徴的なtRNA様構造が見いだされたことから染色体特異的DNA断片は散在型反復配列に由来し、その中のEcoO109Iサイトの変異(Internal repeated sequence variation)を反映するものと考える。これらの染色体特異的DNA断片はS,cerealeの起源の異なる自殖系統間で増幅断片長多型を示したので、STS(sequence-tagged site)化するとともに形態形質との混合分離分析(bulked segregant analysis)によってマッピングする方法を確立した。
以上のように、ライムギゲノムに散在するEcoO109Iサイトにランダムな3つの塩基を付加したプライマーによってPCRの起点となるEcoO109Iサイトが限定され、部位特異的で染色体標識となるDNA断片が効果的に増幅された。
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[Publications] Motonori TOMITA: "EcoO109I repeated DNA families specific to the genome of rye,Secale cereale L." Proceedings of the 8th International Wheat Genetics Symposium. 8. (1993)
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[Publications] 馬 有志: "普通コムギに添加されたAgropyron intermedium染色体の同定に使用できるAg.intermediumに由来する反復DNA配列350bpファミリー" 育種学雑誌. 183-189 (1994)
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[Publications] 富田 因則: "tRNA様構造を持つライムギゲノム特異的SINEファミリー" 育種学雑誌. 44(別1). 20- (1994)
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[Publications] 富田 因則: "EcoO109I認識部位からデザインしたプライマーによる染色体特異的PCR産物のSTS化" 育種学雑誌. 44(別2). 18- (1994)
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[Publications] 富田 因則: "SINE-PCRによるライムギ染色体特異的DNAの増幅" 第17回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集. 17. 326- (1994)
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[Publications] 富田 因則(谷坂隆俊編): "植物遺伝育種学実験法「8.1遺伝子のクローニング」" 朝倉書店, (1995)
