リグニン分解酵素遺伝子を指標とする担子菌ベクター系の開発

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05660092
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 桑原 正章 京都大学, 木質科学研究所, 教授 (40035978)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡邊 隆司 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (80201200)
• Keywords: リグニンペルオキシダーゼ / マンガンペルオキシダーゼ / Bjerkandera adusta / ペルオキシダーゼ / Pleurotus ostreatus / 担子菌

Research Abstract

担子菌における宿主-ベクター系の開発において必要とされるマーカー遺伝子の単離を目的として、リグニン分解系について分子生物学的に研究の進んでいるPhanerochaete chrysosporiumののマンガン依存性ペルオキシダーゼ(以下MnP)遺伝子をPCR法によりクローニングしたところ、mnp-1遺伝子の前半半分の領域をコードしている断片を得ることができた。
次に、Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)を用いて、P.chrysosporiumのmnp-1に相当する遺伝子の単離を行なった。まず、P.ostreatusの染色体DNAを温和な条件で抽出し、制限酵素Sau3AIによって部分分解の後、λベクターにパッケージングしてゲノムDNAライブラリーを得た。このゲノムライブラリーを用いて、mnp-1遺伝子の前半をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションによるスクリーンニングを行なったが、陽性のクローンは得られなかった。そこで、各種のペルオキシダーゼ間で保存されているアミノ酸配列領域から推定した塩基配列を用いてPCRを行なったところ、特異的なバンドの増幅が見られたので、塩基配列を決定した。その結果、西洋わさびペルオキシダーゼの100倍以上の化学発光量を与えるArythromyces ramosusペルオキシダーゼと著しく相同性の高い蛋白質をコードする配列が見つかった。さらに他のクローンの塩基配列について現在解析中である。
一方、Bjerkandera adustaのリグニンペルオキシダーゼ(以下Lip)の4つのアイソザイムを精製し、その一つLPO-2の抗血清を調製した。この抗血清は他のLiPアイソザイムやP.chrysosporiumのLiPと反応することから、これらの酵素には高い類似性を有する抗原性が存在することが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Y.Kimura: "Immunological Test Using Antiserum to Lignin Peroxidase of Bjerkandera adusta" Mokuzai Gakkaishi. 40(印刷中). (1994)
• [Publications] 桑原正章: "木質の生分解を担う微生物システム" 化学と生物. 32. 174-180 (1994)
• [Publications] M.Kuwahara: "Delignification and Production of Ligninolytic Enzymes by Edible Mushrooms" Seventh International Symposium on Wood and Pulp Chemistry. 1. 709-713 (1993)
• [Publications] 樋口隆昌: "木質分子生物学" 文永堂, 271 (1994)