NADP-依存性D-アミノ酸脱水素酵素の触媒機能と構造

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05660100
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 味園 春雄 高知大学, 農学部, 教授 (30027073)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永田 信治 高知大学, 農学部, 助教授 (60180494)
• Keywords: D-アミノ酸脱水素酵素 / D-スレオニン脱水素酵素 / D-フェニルセリン脱水素酵素 / Pseudomonas cruciviae / Pseudomonas syringae / クローニング

Research Abstract

Pseudomonas cruciviaeの構成型D-スレオニン脱水素酵素遺伝子のE.coli JM109へのクローニングを行い、コロニーハイブリダイゼーションでプラスミドpDTDHI4とpDTDH35を得た。さらに、サブクローニングを行い、挿入DNA断片の塩基配列を決定したところ、D-スレオニン脱水素酵素のアミノ酸配列と一致する配列は見られなかった。そこで、N-末端、C-末端アミノ酸配列を決定し、これとペプチド22のアミノ酸配列に基づいて新たにプライマーを合成した。これらのプライマーを用いてPCRを行い、特異的に増幅されるDNA断片をpUC18に連結して、E.coli JM 109に形質転換した。一方、Pseudomonas syringaeの誘導型D-フェニルセリン脱水素酵素遺伝子についても、N-末端アミノ酸配列に基づいて合成したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションで、E.coli JM109へのクローニングを試み、プラスミドp12、p15、p18を得た。これらについて、その挿入DNA断片の塩基配列を決定したところ、D-フェニルセリン脱水素酵素のアミノ酸配列と一致する配列は確認できなかった。そこで、精製酵素からペプチドを単離し、アミノ酸配列を決定して、N-末端アミノ酸配列、ペプチド18のアミノ酸配列、C-末端アミノ酸配列に基づいて、プライマーを作成した。これらのプライマーを用いてP.syringaeの全DNAを鋳型としてPCRを行い、増幅された2種類のDNA断片をpUC18に連結して、E.coli JM109にクローン化した後、塩基配列を決定した。両酵素の一次構造を完全に解明することはできなかったが、N-末端、C-末端アミノ酸配列に違いが認められた。