アポドーシスを誘導する細胞表面抗原: Fasのリガンド遺伝子のクローニング

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05670157
• Research Institution: Osaka Bioscience Institute
• Principal Investigator: 須田 貴司 財団法人大阪バイオサイエンス研究所, 第1研究部, 研究員 (70250090)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長田 重一 〃, 第一研究部, 部長 (70114428)
• Keywords: Fas抗原 / Fasリガンド / アポトーシス / 細胞傷害性T細胞 / 精製 / cDNAクローニング

Research Abstract

Fas抗原はTumor Necrosis Factor(TNF)リセプター、Nerve Growth Factor(NGF)リセプターと類似の細胞膜貫通タンパク質で、特異抗体との反応により発現している細胞自身にアポトーシスを誘導する。我々はFas抗原をリセプターとする未同定のリガンドが存在すると考え、Fasリガンドの同定と、その遺伝子の単離を試みた。1)まず、マウスFas抗原の細胞外部とヒトIgG1のFc部分からなる可溶性のキメラ蛋白(mFas‐Fc)をコードするキメラ遺伝子を作製、発現させ、mFas‐Fcを大量調製した。2)Fas抗原を発現する細胞のみを特異的に傷害するCTLハイブリドーマ(ラットxマウス)PC60‐d10S(以下d10S)において、mFas‐Fcがd10SのFas抗原依存性細胞傷害活性を特異的に阻害すること、mFas‐Fcがd10Sに特異的に結合することをフローサイトメトリーを用いて示し、d10SがFasリガンドを発現していることを明らかにした。3)フローサイトメトリーを用いて、mFas‐Fcにより強く染色される細胞を繰り返しソーティングすることにより、Fasリガンドを強く発現するサブラインを樹立した。4)このd10Sサブラインの膜画分を1%NP‐40で可溶化し、その遠心上清よりmFas‐FcカラムとConcanavalin Aagarose beadsを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより分子量40kDの糖タンパク質(gp40)を精製した。5)この精製gp40はそれ単独で、Fas抗原を発現する細胞に対し特異的に細胞死を誘導し、機能的なFasリガンドであることを明かにした。さらに、6)d10SサブラインよりcDNA libraryを作製し、COS細胞に発現させ、mFas‐Fcを用いたパニング法によりFasリガンドcDNAの単離に成功した。このFasリガンドcDNAはラット由来のものであった。7)単離されたラットFasリガンドcDNAは、278アミノ酸からなり、TNF/NGFファミリーに属するタイプII膜蛋白質をコードしていた。8)ノーザンブロット法により、精巣及び活性化された脾細胞と胸腺細胞でFasリガンドmRNAが発現していることを見いだした。

Research Products

• [Publications] Takashi Suda et al.: "Molecular cloning and expression of the Fas ligand:a novel member of..." Cell. 75. 1169-1178 (1993)
• [Publications] Takashi Suda et al.: "Purification and characterization of the Fas‐ligand that induces apoptosis." Journal of Experimental Medicine. (発表予定). (1994)
• [Publications] Jun.Ogasawara et al.: "Lethal effect of the anti‐Fas antibody in mice." Nature. 364. 806-809 (1993)
• [Publications] Takashi Suda et al.: "Differentiation and repertoire selection of CD3^+CD4^-CD8^-,..." Journal of Immunology. 150. 447-455 (1993)