プラスミドRts1の複製必須蛋白の野生型と変異型の比較研究

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05670249
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 田渕 晃 信州大学, 細菌学教室, 助手 (50236725)
• Keywords: DNA複製 / プラスミドの自己複製 / 複製必須蛋白 / DNA結合蛋白 / 不和合性

Research Abstract

温度感受性プラスミドRts1の複製に必須なRepA蛋白の機能について主に実験を行っている。今までに、変異型RepA蛋白のうち、特に興味深いz279と命名されたもの(不和合性はあるが、ori-activation活性を持たない。)の部分精製標品を用いて、DNA結合能及び結合パターンを、Gel shift assay法で解析した。次に示す様な、5つのフラグメントをDNAプローブとして用いた。
(1)Rts1のorigin及びincII領域を含む250bp Bg〓I-HindIIIフラグメント
(2)Rts1のorigin及びincII領域さらにRepA蛋白をコードする遺伝子のoperator promoter領域を含む420bpのBg〓I-EcoT14Iフラグメント
(3)incI領域を含む350bpのEcoRV-EcoRIフラグメント
(4)RepA遺伝子のoperator promoter領域を含む190bpのHindIII-EcoT14Iフラグメント
その結果、いづれのフラグメントを用いた場合においても、野生型RepA蛋白とほぼ同様の結合パターンを示した。
RepA蛋白構造遺伝子のプロモーター領域をlac遺伝子上流にクローニングしたlac-fusionを用いて、変異型RepAz279蛋白のrepressor活性を調べた結果、野生型とほぼ同様のrepressor活性を示したという成績を既に得ているが、あわせ考慮すると、変異RepA蛋白z279のアミノ酸の変異、即ち279番目のアルギニンのグリシンへの変異は、そのautorepressor活性及びDNA結合能には何ら影響を与えないという結論に導かれる。
それでは、観察上、そのconformation及びDNA結合能に、wild-typeとは大きな違いの認められない変異RepAz279蛋白が、なぜRts1 oriを活性化しないか、そのfactorを見い出すことが、今後の興味深い焦点の1つとなった。