ボツリヌスC型毒素に対する受容体遺伝子のクローニング

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05670261
• Research Institution: SAPPORO MEDICAL UNIVERSITY
• Principal Investigator: 藤井 暢弘 札幌医科大学, 医学部, 教授 (90133719)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 浩一 札幌医科大学, 医学部, 助手 (90177915) ; 横沢 紀子 札幌医科大学, 医学部, 講師 (50167722)
• Keywords: ボツリヌスC型毒素 / 結合蛋白質 / 受容体蛋白質 / 遺伝子クローニング

Research Abstract

昨年の検討において、NG108細胞からmRNAを抽出した後,cDNAの合成を行いZAP-XRベクターにクローニングし,得られたcDNAライブラリーからボツリヌスC1毒素に対する結合性蛋白質を産生しているクローンの選別を試みたが,バックグラウンドが高いために明かな陽性クローンの選別には成功しなかったことを報告した。 蛋白プローブとして神経毒素(分子量15万)全体を使用しているために擬陽性クローンが多くなる可能性が考えられるので,神経毒素の標的神経細胞への結合ドメインを含む領域を蛋白プローブとして用いることとした。 このため、C1毒素遺伝子の3'-末端側約650塩基(約200アミノ酸残基)に相当する領域をPCR法で増幅し,pBluescript-IIにクローニングした後, ET発現ベクターに再クローニングした。 pETベクターからの結合性蛋白質の発現は,C1毒素結合ドメインを認識している数種のモノクローナル抗体との反応性(ウエスタンブロット法)とNG108細胞へのC1毒素の結合を阻害することから確認した。
一方,NG108細胞膜上に存在すると考えられるC1毒素に対する蛋白質性の受容体を単離して抗体を作成し,イムノスクリーニングによってcDNAライブラリーから陽性クローンを得るために,C1毒素あるいは結合ドメインを用いてNG108細胞膜蛋白質とのクロスリンク-免疫沈降法による検討を試みている。