1994 Fiscal Year Annual Research Report
バセドウ病患者における甲状腺刺激ホルモンレセプター特異的T細胞株の樹立と解析
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05670839
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| Research Institution | CHIBA UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
田原 和夫 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (60241965)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平井 愛山 千葉大学, 医学部, 助手 (10189813)
下条 直樹 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (40221303)
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| Keywords | 甲状腺刺激ホルモン / バセドウ病 / 自己免疫 / 甲状腺刺激抗体 / 動物モデル / キメラレセプター / T細胞エピトープ / B細胞エピトープ |
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| Research Abstract |
1.ヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター(TSHR)特異的T細胞の解析
(1)ヒトTSHR細胞外ドメイン蛋白質の発現
ヒトTSHRの細胞外ドメインをコードする1.2kbのcDNAフラグメントをpolymerase chain reaction(PCR)にて増幅し、バキュロウィルスに組み込んでSf9細胞で蛋白を発現させた。この産生された蛋白はSDS-PAGEで分析した結果、分子量50kDaであり、しかもヒトTSHR細胞外ドメインの特異的な抗ペプチド抗体で検出された。これをゲル精製して、家兎に免疫し抗体を作成したところ、この抗体は、TSHRと^<125>I-TSHの結合を阻害した。すなわち、この抗体は抗TSHR抗体であり、このバキュロウィルスを用いて作成した細胞外ドメインは抗原として使用できることが明らかとなった。
(2)マウスモデルにおけるTSHR特異的T細胞の解析
ヒトTSHR細胞外ドメインを用いてのバセドウ病患者からのTSHR特異的T細胞株の分離は、これまでの試みで成功しなかった。そこで多くの実験上の制約を伴うヒトT細胞の解析と平行して、マウスモデルによるT細胞応答性を検討した。まず、full lengthのヒトTSHRcDNAをマウス線維芽細胞(RT)にリボフェクチンをもちいて遺伝子導入し、ヒトTSHR発現RT細胞株(RT-TSHR)を得た。このRT-TSHRをマウスに免疫し、その脾細胞を解析すると、TSHR特異的な芽球化反応を認めた。すなわち、マウスMHCであるH-2のうち、少なくとも、kハブロタイプはTSHR分子をT細胞に抗原提示できることが明らかになった。
2.抗ヒトTSHR抗体のエピトープの解析
ヒトTSHR特異的T細胞のエピトープとB細胞のエピトープ(抗体のエピトープ)の関係は大変重要な問題と考えられる。そこで、B細胞のエピトープについても検討した。まず、ヒトTSHR細胞外ドメインの一部をラット黄体化ホルモンレセプター(LH/CGR)と置換したキメラレセプターを作成した。これらのキメラレセプターのうち、THSまたはLH/CGに反応するレセプター機能を保持したものを用いて、バセドウ病患者の刺激抗体が、これらのレセプターを刺激して、cAMP産生を促進するか否かを検討して、抗体のエピトープを解析した。その結果、刺激抗体のエピトープは、主としてTSHRのN端側の約145アミノ産の範囲内にあり、患者によりそのエピトープが異なる事が明らかとなった。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Seetharamaish,G.S.: "Induction of TSH binding inhibitory immunoglobulins with the extracellular domain of human thyrotropin receptor produced using baculovirus expression system." Autoimmunity. 14. 315-320 (1993)
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[Publications] Desai,R.K.: "Dual mechanism of perturbation of thyrotropin-mediated activation opf thyroid cells by antiboddies to the thyrotropin receptor (TSHR) and TSHR-derived peptodes." J.Clin.Endocrinol.Metab.94. 658-663 (1994)
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[Publications] Hidaka,A: "Thyrotropin stimulation of the Iutropin/choriogonadrotropin receptor:different sites mediate agonist activity and high affinity binding." Thyroid. 4. 447-457 (1994)
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[Publications] Kazuo Tahara: "80years of Hashimoto disease" Elsevier Science Pblishers,Amsterdam, 657-677 (1993)
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[Publications] Kohn,L.D.: "Molecular endocrinology:Basic concepts and clinical correlations" Raven Press,Ltd.,New York, 133-153 (1994)
